家蠶兩種乙醯膽鹼酯酶基因的互作及突變研究

《家蠶兩種乙醯膽鹼酯酶基因的互作及突變研究》是依託蘇州大學，由李兵擔任項目負責人的面上項目。

基本介紹

• 中文名：家蠶兩種乙醯膽鹼酯酶基因的互作及突變研究
• 項目類別：面上項目
• 項目負責人：李兵
• 依託單位：蘇州大學

項目摘要

家蠶是重要的經濟昆蟲，對農藥的抗性弱，每年都會發生中毒事件，影響蠶絲業健康發展，迫切需要闡明家蠶對農藥抗性弱的分子機制。已有的研究表明，乙醯膽鹼酯酶基因（ace）相關位點的突變是昆蟲產生抗藥性的主要機制，家蠶具有兩種類型的ace，但兩種基因的互作關係、關鍵位點的突變和抗藥性關係，還沒有相關的報導。本研究採用RNAi技術，分別對1型和2型進行沉默，研究兩種ace的互作；採用定點突變、Bac-to-Bac桿狀病毒表達系統和轉基因打靶技術，通過對ace相關位點的突變，對突變前後的基因進行體外表達，檢測表達產物對底物的敏感性；利用ace的基因組作為同源臂、ace的啟動子作為轉基因載體的啟動子，A3-GFP作為報告基因，構建經突變的ace轉基因載體，通過精子介導對家蠶進行轉基因研究。通過對轉基因個體的篩選、繼代，檢測後代對有機磷農藥的抗性。闡明ace突變和功能的關係，為家蠶的抗藥性品種選育打下基礎。

結題摘要

本課題測定了5齡第3天家蠶對辛硫磷農藥的LC50，檢測了添食低濃度辛硫磷農藥後不同時間在不同組織中兩種乙醯膽鹼酯酶基因的轉錄特徵。採用了RNAi方法對家蠶BmN細胞系中ace1和 ace2在進行了沉默，研究了兩種基因功能和相互之間的關係。為了研究ace1突變對其抗藥性的影響，我們採用定點突變的方法對Ala(GCG)303Ser(TCG), Gly(GGA)329Ala(GCA) 和 Leu (TCT)554Ser(TTC)進行了同時突變。並且通過桿狀病毒表達系統分別表達了突變型和野生型兩種ace1，SDS-PAGE 和Western blotting分析表明表達蛋白分子量的大小為76 kDa。測定了經過純化的表達產物的AChE活性和對專一性抑制劑（毒扁豆鹼和辛硫磷）的敏感性。結果表明，ace1和 ace2經辛硫磷誘導後在腦、脂肪體和絲腺中呈現先增加後減少的趨勢，在24h腦中的ace1和 ace2分別增加了16.22和68.71倍，在脂肪體和絲腺中的增加較少，在中腸中ace1和 ace2的轉錄水平呈現先減少後增加的特徵，結果還表明ace1和 ace2在不同組織的解毒過程中表現不同的特徵，推測ace1在脂肪體的解毒過程中發揮重要的作用，而ace2在腦中發揮重要的作用。我們發現ace1被沉默後表達量下降到37.5%時，ace2的表達量增加了66%；當ace2被沉默後表達量下降到33.4%，ace1表達量也下降到原來的26.7%。當ace2被沉默後，其AChE活性下降到原來的86.2%，ace1被沉默後，其AChE活性不變。本研究結果表明，ace2對ace1的表達具有補償作用，對ace1的表達也具有調控作用，將有助於研究鱗翅目昆蟲兩種乙醯膽鹼酯酶基因的相互關係。定點突變的研究結果表明，突變型和野生型的AChE活性不存在差異，但對專一性抑制劑的敏感性存在差異，即突變後對抑制劑的敏感性降低，表明3個位點的突變對其抗藥性有影響，為研究提過AChE突變提高昆蟲抗藥性奠定了基礎。