家兔胚胎幹細胞與其種質傳遞機制的研究

《家兔胚胎幹細胞與其種質傳遞機制的研究》是依託南京師範大學，由杜福良擔任項目負責人的面上項目。

基本介紹

• 中文名：家兔胚胎幹細胞與其種質傳遞機制的研究
• 項目類別：面上項目
• 項目負責人：杜福良
• 依託單位：南京師範大學

項目摘要

本研究旨在建立具有種質潛能的家兔胚胎幹細胞（rbES），研究其自我更新與種質傳遞的機理。家兔是研究許多人類疾病的優勢動物模型。rbES 建立已近20年。但至今，全世界仍無一團隊證明rbES能繼續分化成特殊生殖細胞, 具備種質傳遞的潛能，使家兔模型未能廣泛套用。目前對rbES的自我更新和維持的機制還存在爭議。我們的前期研究證實：（1）兔胚飼養層細胞(REF)與重組家兔白血病抑制因子（rbLIF）對rbES的獲取與維持具有促進作用；（2）確定了維持rbES自我更新的幾個重要信號通路分子。我們推測控制rbES自我更新的信號通路將極大地影響幹細胞的種質傳遞能力。我們將創新性地利用REF、rbLIF和特定的rb-2iF培養基獲得新的rbES，加深對rbES自我更新和細胞分化調控通路的認識；利用GFP標記的rbES，研究其體外與體內分化的態勢，並揭示rbES在嵌合體中傳遞成生殖系細胞的規律。

結題摘要

家兔是研究許多人類疾病的優勢動物模型。家兔胚胎幹細胞（rbESC） 建立已近20年。但至今，全世界仍無一團隊證明rbESC能繼續分化成生殖細胞, 具備種質傳遞的潛能，限制了家兔模型廣泛套用。我們檢測了rbESC自我更新相關的信號通路中的多種因子，結果顯示bFGF通過激活FGF信號通路對rbESC細胞的自我更新中起著關鍵性的作用，Noggin通過抑制BMP信號通路從而抑制rbESC分化。我們利用不同濃度的細胞因子研究出rbESC培養基iFLY，確定了維持rbECS自我更新的最佳劑量，LIF、bFGF、Noggin的濃度分別在103IU/ml、40ng/ml、400 ng/ml時培養效果最佳。利用玻璃化冷凍囊胚獲取了rbESC細胞系，與從新鮮的囊胚中獲取rbESC的效率相比無顯著差異，GFP標記的rbESC細胞系可產生嵌合體兔仔。表觀修飾與多能性關鍵因子的表達對植入前胚胎獲得發育多能性至關重要。我們系統地研究了植入前兔胚胎在體內發育過程中組蛋白H3K4me3、H3K27me3修飾水平及Nanog表達動態模式，為分離rbESC的分離提供數據支撐。在此基礎上探索了Naïve態rbESC的分離，通過小分子調製相關信號通路，分離到Naïve-like態rbESC。實驗結果顯示在3i條件下，抑制GSK3 (CHIR99021)、MEK (PD0325901)、PKC (Gӧ6983)信號通路，分離到“Dome-shaped” 形態rbESC，證明“Dome-shaped”形態維持與抑制PKC信號直接相關。目前rbESC領域相關研究進展較少，我們的研究結果填補了rbESC研究的空白，確立了naive態rbESC維持所需的信號通路條件、冷凍胚胎是否能分離到rbESC、並用GFP標記了rbESC，為幹細胞胚胎嵌合驗證提供了遺傳標記材料等。同時我們證實在家兔中可以建立起Naïve態rbESC，為後續研究提供了珍貴的研究數據和材料，為後續突破奠定了基礎。