奶牛乳腺脂類合成代謝轉錄調控機制與基因網路構建

《奶牛乳腺脂類合成代謝轉錄調控機制與基因網路構建》是依託揚州大學，由楊章平擔任項目負責人的面上項目。

基本介紹

• 中文名：奶牛乳腺脂類合成代謝轉錄調控機制與基因網路構建
• 項目類別：面上項目
• 項目負責人：楊章平
• 依託單位：揚州大學

項目摘要

本項目旨在前人研究基礎上，以中國荷斯坦奶牛為研究對象，利用轉錄組測序、microRNA測序、酵母雙雜交試驗等高通量技術和生物信息學方法，研究乳腺組織在一個完整泌乳期（從妊娠後期至泌乳結束）內，其分泌細胞從血液中獲取脂肪（FA import into cells）、脂肪酸從頭合成（de novo synthesis）、外源固醇轉運、脂肪酸激活及胞內運送、脂肪酸細胞內合成和去飽和（Fatty acid synthesis and desaturation）至脂滴形成和分泌（Lipid droplet formation and secretion）等代謝過程的轉錄及轉錄後調控機制，並在轉錄水平上探索脂肪生成、代謝調控和乳腺免疫調控的相互關係，為釐清奶牛乳腺細胞脂肪合成、代謝機制，實現乳成份的定向調控選種，生產優質原料奶奠定實驗基礎。

結題摘要

奶牛泌乳是一個動態過程，本研究在跟蹤測定中國荷斯坦奶牛一個完整泌乳周期中乳成分、乳脂肪酸水平的基礎上，在泌乳的特定6個時間段採集乳腺組織，運用轉錄組測序和生物信息學分析技術篩選差異表達基因，獲得與乳脂代謝相關的基因，結合脂肪酸變化趨勢和規律探索與脂肪酸代謝相關基因的表達模式，旨在進一步發掘泌乳周期中乳脂相關基因及其調控機制。選擇體況相近、分娩時間接近（±3d）的2胎奶牛3頭，微創採集分娩前7d及泌乳30、90、180、270、315d乳腺組織，液氮保存，用於提取RNA，進行轉錄組分析。本研究根據NCBI中的牛SIRT2基因序列，在其保守區設計特異性引物，以中國荷斯坦奶牛脂肪組織為cDNA模板克隆SIRT2 基因；對克隆得到的基因進行序列分析；以GAPDH 基因為內參基因分析SIRT2 在中國荷斯坦奶牛的心臟、肝臟、腎臟、肺、胃、結腸、肌肉、脂肪等8個組織的表達水平；構建pDsRed-SIRT2真核表達載體並轉染到293-A細胞系中表達，觀察融合蛋白的亞細胞定位；使用預測軟體預測了泌乳差異表達的miRNA中三個靶向調控SIRT2基因的miRNA：miR-212、miR-375和miR-655，以乳腺上皮細胞系（mac-T）及人腎上皮細胞系（293T）為模型，通過螢光定量PCR技術、雙螢光素酶報告基因技術等篩選出一個靶向SIRT2基因的miRNA；通過過表達和抑制表達miRNA-212後測得脂肪相關基因SREBF1、SCD、FAS、LPL及PPARG的相關表達量並且通過EDU和油紅O染色實驗證明miRNA靶向SIRT2基因對乳腺上皮細胞系中脂肪生成的影響。研究使用螢光素酶報告和Western Blot試驗對表達差異顯著的miR-106b 和ABCA1調控關係進行驗證。miR-106b與關鍵的miR-106b靶標（ABCA1）一起提供潛在的miRNA-mRNA調節對；在奶牛乳腺上皮細胞過表達miR-106b可以抑制乳脂代謝，而抑制miR-106b可以促進乳脂代謝。通過甘油三酯、膽固醇等實驗證明ABCA1在乳腺上皮細胞中促進乳脂代謝。通過補救試驗驗證了miR-106b通過ABCA1調控乳脂代謝。本研究構建了miR-106b- ABCA1調控網路圖，揭示miR-106b- ABCA1途徑調控牛奶乳脂代謝的分子機理，為提高牛奶品質提供理論依據。