《大腸桿菌L-色氨酸合成的調控及分子改造研究》是依託山東大學，由祁慶生擔任項目負責人的面上項目。
基本介紹
- 中文名：大腸桿菌L-色氨酸合成的調控及分子改造研究
- 項目類別：面上項目
- 項目負責人：祁慶生
- 依託單位：山東大學
中文摘要,結題摘要,
中文摘要
L-色氨酸(L-Tryptophan)是一種重要的芳香性胺基酸，是人體和動物生命活動所必需的8種胺基酸之一，在食品、醫藥飼料等行業具有廣泛 套用。大腸桿菌L-色氨酸的合成途徑比較複雜，兩種前體物分別是糖酵解途徑的中間產物磷酸烯醇式丙酮酸（PEP）和磷酸戊糖途徑的中間產物赤醯糖-4-磷酸（E4P），並且其代謝合成受多種調控因子的多層次調控。本研究首先從大腸桿菌L-色氨酸的合成途逕入手，利用基因敲除、定點突變、啟動子改造等手段，對反饋抑制、阻遏作用、前體物水平等限制性因素進行分析，研究它們對L-色氨酸合成的影響，從而構建出L-色氨酸的基本發酵菌株。然後利用RT-PCR，轉錄組學等技術，對基本發酵菌株進行分析，探索大腸桿菌L-色氨酸合成的未知的限制性因素和分泌機制，完善大腸桿菌L-色氨酸的合成與代謝的調節網路，並在此基礎上，構建高效積累L-色氨酸的大腸桿菌工程菌。
結題摘要
L-色氨酸作為一種非常重要的芳香性胺基酸，對人和動物的生長發育起重要作用，廣泛套用於食品、醫藥、飼料等方面。本項目利用基因的敲除、定點突變及過量表達等技術，對野生型大腸桿菌W3110進行了代謝工程改造。通過敲除阻遏蛋白TrpR，色氨酸酶TnaA，以及編碼葡萄糖依賴的磷酸轉移酶系統中酶IIBC組分的ptsG基因，並過量表達了定點突變解除反饋抑制的鄰氨基苯甲酸合成酶trpE3、3-脫氧-D-阿拉伯庚酮酸-7磷酸（DAHP）合酶aroG1以及磷酸戊糖途徑中編碼轉酮酶的基因tktA，構建了L-色氨酸基本產生菌株GPT1001。搖瓶發酵顯示該菌株的L-色氨酸可以達到1.2 g l-1。在此基礎上，一步法完成了色氨酸衰減子的敲除及色氨酸操縱子野生型啟動子的替換，成功構建了重組大腸桿菌GPT1002。RT-PCR檢測到五個色氨酸操縱子基因的轉錄均出現上調。搖瓶發酵實驗表明，GPT1002的生長未受到影響，並且可以積累1.7 g l-1的L-色氨酸，比對照菌株GPT1001高出41.7%。在5-l發酵罐中，L-色氨酸產量可以達到10.15 g l-1。進一步改造Mtr、TnaB和AroP 三個透過酶，L-色氨酸產量可以達到16.3 g l-1。利用色氨酸和聚β-羥基丁酸（PHB）聯產，能夠顯著提高色氨酸操縱子基因的轉錄。通過嘗試以不同比例的葡萄糖和木糖作為碳源並對兩種產物及副產物進行分析，確定了兩種碳源的最優組合，為L-色氨酸的工業化生產提供了重要的研究基礎。
