《基於DNA支架的酶集結效應和逆向代謝工程富集1,4-丁二醇》是依託北京化工大學，由袁其朋擔任項目負責人的面上項目。
基本介紹
- 中文名：基於DNA支架的酶集結效應和逆向代謝工程富集1,4-丁二醇
- 依託單位：北京化工大學
- 項目類別：面上項目
- 項目負責人：袁其朋
項目摘要,結題摘要,
項目摘要
1,4-丁二醇是具有廣泛套用價值的重要化合物，但尚未發現其天然生物合成。本研究擬在大腸桿菌中構建其組合生物合成途徑。由於酶催化形成中間產物的積累及擴散極大降低1,4-丁二醇的產量，本研究擬構建DNA支架將關鍵酶依照催化順序集結在一起，可望提高底物轉化率及1,4-丁二醇產量。為了繼續提高產量，利用晶片分析高產菌與對照菌的差異表達基因，然後對其進行KEGG代謝途徑定位和染色體定位，據此推斷影響產量的關鍵途徑和關鍵酶，鎖定調控節點；採用逆向代謝工程策略調節轉錄水平，包括改造調控基因，強化上調基因的啟動子或弱化下調基因的啟動子，可進一步提高產量。本研究借鑑植物數量性狀的研究思路，闡明影響1,4-丁二醇產量的關鍵途徑和調控節點這一科學問題。將局部模組途徑強化與逆向代謝工程相結合，可充分積累1,4-丁二醇，為微生物分子育種新思路。本研究不僅獲得高產菌，而且為其他大宗工業菌種的遺傳改造奠定理論基礎。
結題摘要
1,4-丁二醇因其特殊的化學結構而成為一種重要化學品，廣泛套用於化工、醫藥、紡織、造紙和汽車等領域。本研究利用蛋白質工程手段進行一系列理性設計及改造，通過降低空間位阻、擴大催化中心及最佳化催化距離等方式，將一個不可催化1,2,4-丁三醇的丙二醇脫水酶成功的改造為可催化該底物生產1,4-丁二醇的酶；同時，利用代謝工程方法構建了一個木糖高效利用平台菌株，可通過5步反應將木糖轉化為α-酮戊二酸，這條通路沒有碳損失，理論摩爾得率達到100%。以此為基礎，構建了一條全新的、高效的1,4-丁二醇代謝通路，1,4-丁二醇搖瓶產量達到209mg/L。另外，本研究還利用該平台菌株生產了一種高附加值產物，3,4-二羥基丁酸，通過敲除競爭性代謝途徑等代謝網路的最佳化，最終搖瓶產量達到1.27g/L。同時，我們以戊二酸為模板產物，研究了新構建的木糖高效利用平台與大腸桿菌固有木糖利用途徑的關係，在生產以α-酮戊二酸為前體的產物時，新的木糖高效利用平台比大腸桿菌固有的利用途徑更為高效，而在生產以α-酮戊二酸及乙醯-CoA為前體的產物時，兩者的協同效果可以增加目的產物的產量，利用率高於葡萄糖。本研究還探究了葡萄糖與第二碳源的利用方式，構建了新的葡萄糖高效利用平台。我們阻斷了葡萄糖的中心代謝途徑，以甘油為第二碳源，產生PEP轉運葡萄糖，同時生成的PYR則提供細胞生長，該設計巧妙的將多糖的生產過程與細胞的生長偶聯起來，實現了兩種碳源的協同偶聯利用，利用該平台生產海藻糖，搖瓶產量達到8.2g/L。在此基礎上，我們構建了葡萄糖及木糖的協同利用平台，實現半纖維素水解物的高效利用，木糖支持細胞生長而葡萄糖作為底物生產海藻糖，搖瓶產量達到5.55g/L。 研究還以合成生物學的思想構建了芳香族化合物的合成平台，通過酶的篩選及途徑最佳化，將一系列酶進行“即插即用”的組合，生產了三種木質素單體及苯酚。另外，我們通過SELEX篩選技術，獲得了能與柚皮素結合的RNA片段，構建了新的核糖開關，開發了新的生物感測器。 研究共發表25篇文章，其中本領域TOP文章12篇。
