《基於能量代謝調控的SAM和GSH聯合高產機制研究》是依託蘇州大學，由衛功元擔任項目負責人的面上項目。
基本介紹
- 中文名：基於能量代謝調控的SAM和GSH聯合高產機制研究
- 項目類別：面上項目
- 項目負責人：衛功元
- 依託單位：蘇州大學
項目摘要,結題摘要,
項目摘要
能量代謝普遍存在於各類微生物反應過程中，調控胞內與能量代謝有關輔因子的水平和比率，將有助於促進耗能合成的生物基化學品的過量合成。本項目以一株能發酵聯產S-腺苷甲硫氨酸（SAM）和谷胱甘肽（GSH）的產朊假絲酵母CCTCC M 209298作為出發菌株，採用基因工程技術過量表達3-磷酸甘油醛脫氫酶基因（gapA）和ATP6基因，同時敲除線粒體膜孔蛋白Por1p基因，構建一系列胞內NADH和(或)ATP合成和利用速率明顯提高的突變株。藉助轉錄組學和蛋白質組學技術方法，解析參與能量代謝調控的關鍵因子。比較突變株和出發菌株在生長特性、物質代謝、胞內微環境（pHi、氧化還原狀態）、關鍵酶活性等方面的差異，總結輔因子水平和比率與SAM和GSH聯產之間的相關性。研究結果將有助於深入理解能量代謝調控在SAM和GSH聯合高產中的作用機制，同時也為其他類似耗能發酵產品的高效生產及其菌株改良提供新的思路。
結題摘要
本項目以產朊假絲酵母為研究對象，利用基因工程技術對出發菌株C. utilis CCTCC M 209298進行遺傳改造，篩選獲得胞內能量代謝物質水平明顯提高的突變株C. utilis Δpor1和C. utilis ATP6。主要研究成果包括：（1）敲除產朊假絲酵母線粒體膜上的por1基因，成功構建突變株C. utilis Δpor1。結果發現por1基因敲除提高了SAM合成酶和γ-谷氨醯半胱氨酸合成酶的活性，提升了胞內NADH和ATP水平，突變株SAM和GSH的產量分別比出發菌株提高了28.4%和39.1%。轉錄組測序分析結果表明，por1基因敲除激活或上調了多種蛋白酶調控子以及能量代謝相關基因的表達。（2）將來源於擬南芥的ATP6基因過表達至出發菌株中，成功構建突變株C. utilis ATP6，結果發現突變株中的ATPase活性比出發菌株平均提高了31.4%；突變株胞內NADH和ATP水平明顯提高，胞內SAM和GSH含量分別比出發菌株高出38.1%和20.8%。（3）發現弱酸脅迫有利於出發菌株合成GSH和對硒的富集，通過對酵母胞內關鍵酶活進行測定，發現弱酸脅迫不僅提高了GSH合成酶的活性，而且有助於提高酵母細胞的抗氧化能力。轉錄組測序分析結果表明，弱酸脅迫會激活或上調大量初級代謝、大分子代謝以及含氮化合物代謝，尤其是有機硒轉化和GSH生物合成代謝，以及ATP合成途徑相關的基因表達，從而進一步提高有機硒和GSH的含量及其在胞內的富集。（4）考察不同溶氧條件對SAM和GSH聯產發酵的影響，結果發現30%的恆溶氧水平均有利於出發菌株和C. utilis Δpor1合成SAM和GSH。分批發酵過程參數分析結果表明，該溶氧水平不僅提高了SAM和GSH合成關鍵酶的活性，而且增加了胞內ATP的水平，為SAM和GSH的過量合成提供了充足的能量基礎。（5）發現在分批發酵過程中添加丙酮酸鈉可以促進SAM和GSH聯合高產。實驗結果表明，丙酮酸鈉作為一種輔助能量物質，提高了SAM合成酶、γ-谷氨醯半胱氨酸合成酶、己糖激酶和異檸檬酸脫氫酶的活性，同時增加了胞內ATP的供給，為SAM和GSH過量合成提供了充足的能量物質。以上這些研究結果為類似耗能合成化合物的高效生產提供了可行的思路。項目執行期間，發表學術論文10篇，其中SCI收錄6篇；申請國家發明專利3項；培養碩士研究生5名。
