《基於核酸探針可控自組裝的小RNA活體細胞成像分析》是依託河北大學，由李正平擔任項目負責人的重大研究計畫。
基本介紹
- 中文名：基於核酸探針可控自組裝的小RNA活體細胞成像分析
- 項目類別：重大研究計畫
- 項目負責人：李正平
- 依託單位：河北大學
項目摘要,結題摘要,
項目摘要
在本項目中，小RNA包括microRNA及小干擾RNA在活體細胞內生成的單鏈小RNA，其活體細胞成像分析對於microRNA生物功能的深入研究，重大疾病的早期診斷及基因治療藥物的開發都具有重大意義，也是目前尚待突破的瓶頸問題。本項目擬通過設計莖環結構的DNA探針，由小RNA引發DNA探針的一維、二維、三維可控自組裝，形成以核酸雜交反應為動力的DNA納米機器；建立多層次、多組分的可控自組裝新方法。通過最佳化設計，揭示自組裝過程的調控規律，建立高靈敏度生物兼容的識別與感測體系；形成在活體細胞生理條件下，無需任何酶催化的高靈敏度、高特異性分析檢測小RNA的自組裝新技術，並將其套用於小RNA活體細胞成像分析，突破小RNA分析中的瓶頸問題。通過發展以生物功能為導向的自組裝體系，大大促進microRNA生物功能的深入研究及基因治療藥物的開發。
結題摘要
在本項目的資助下，以microRNA（miRNA）為模式目標分子，基於核酸探針的可控自組裝，對小RNA的成像分析及均相溶液中小RNA高靈敏度檢測進行了系統的研究。首先設計了針對miRNA目標分子的莖環結構DNA探針，該DNA探針與miRNA分子雜交，可以引發雜交鏈式反應（HCR）形成一維結構的雙鏈DNA；該DNA進一步在氧化石墨烯（GO）表面自組裝，可形成三維組裝體系，並富集DNA探針標記的螢光基團，實現miRNA高靈敏度的螢光成像分析。同時，我們研究了磁性微球表面由miRNA引發的HCR，形成三維結構的自組裝體系，可直接用於miRNA的螢光成像分析；也可以用流式細胞儀檢測磁性微球表面的螢光，實現miRNA的靈敏檢測。我們設計了兩個莖環結構的DNA探針。miRNA與DNA探針雜交，形成以miRNA目標分子為催化劑的催化自組裝體系，可套用於均相溶液中直接檢測miRNA。以上自組裝體系一般能靈敏地檢測pmol/L ~ nmol/L的小RNA分子。 為了進一步提高檢測小RNA分子的靈敏度，我們設計了線性的兩組（四個）DNA探針，miRNA與兩個DNA探針雜交組裝為有缺口的二維結構；利用連線酶將缺口連線生成一個新的DNA鏈，該DNA鏈作為模板連線另外兩個DNA探針。這樣，每一次連線形成的DNA鏈都可以作為下一輪連線DNA探針的模板，形成連線酶鏈式反應（LCR）的指數擴增體系。該擴增體系可檢測低至0.2 fmol/L的miRNA分子，大大提高了檢測靈敏度。針對不同的miRNA分子，對DNA探針進行長度編碼，使不同的miRNA分子形成不同長度的LCR產物，經電泳分離，可同時檢測多重miRNA分子。該擴增體系同時也套用於高靈敏度檢測信使RNA（mRNA）及DNA甲基化。 小RNA是mRNA翻譯為蛋白質過程中重要的調控因子，蛋白激酶和磷酸化酶催化的蛋白質磷酸化和去磷酸化是翻譯後的重要調控機制。基於磷酸化肽的自組裝體系，我們研究了一系列高靈敏度的檢測蛋白激酶和磷酸化酶活性的分析方法。
