基於數字基因表達譜分析的寒蘭試管成花分子機理研究

《基於數字基因表達譜分析的寒蘭試管成花分子機理研究》是依託南昌大學，由羅火林擔任項目負責人的地區科學基金項目。

基本介紹

• 中文名：基於數字基因表達譜分析的寒蘭試管成花分子機理研究
• 項目類別：地區科學基金項目
• 項目負責人：羅火林
• 依託單位：南昌大學

項目摘要

試管成花技術可縮短蘭科植物從種子到開花所需的時間，促進該科植物的相關理論研究與資源開發。然而，相關的分子機理尚未明了，體外開花中的花芽誘導率低、花期短、可育性差等問題普遍存在，並且試管開花的誘導將增加操作的成本和技術難度。基於課題組在寒蘭試管成花方面的研究基礎，本研究擬對寒蘭花芽進行RNA-seq結合數字基因表達譜分析，可全面揭示成花過程中基因表達的動態變化；並利用Real-time PCR和RNA原位雜交技術對所得的差異基因進行驗證，以期得到在寒蘭試管成花中起關鍵作用的開花基因；再克隆開花基因的啟動子，結合其在菸草葉片中的瞬時表達，以明確開花調控特性；最後通過對擬南芥的基因超表達，全面解析所得的寒蘭開花基因的功能。本項目的實施，對正確理解以寒蘭為代表的蘭科植物試管成花的分子機理具有重要意義，同時，為推進蘭花的早花育種奠定堅實的基礎。

結題摘要

包括寒蘭在內的蘭科植物從種子到開花所需時間非常長，嚴重地制約了花發育的相關研究以及新品種培育，所以寒蘭試管開花分子機制的研究具有重要意義。項目首先利用qRT-PCR技術結合生物信息分析評價了9個常用的內參基因在寒蘭不同組織中以及激素處理和非生物脅迫條件下的表達穩定性，然後對獲得的68,699條Unigene進行SSR位點分析，為寒蘭基因表達分析與SSR引物開發奠定基礎。寒蘭試管苗的花芽分化進程可分為花芽分化前期（a）、苞片原基分化期（b）、花原基分化期（c）、花被原基分化形成期（d）、合蕊柱分化期（e）、花粉囊和柱頭形成期（f）等6個時期。對寒蘭前三個時期的花芽進行DGE分析，通過對三個轉錄組資料庫的比較，共獲得23,720個差異表達基因，從中篩選出與成花過程有關的9個基因，分別為：CkFPA，CkGA2OX，CkGID1，CkCO，CkPHYB，CkELF3，CkFRI，CkFLC和CkAP1。通過RT-qPCR技術，驗證9個差異表達基因在寒蘭成花過程中的表達模式，發現其中CkFPA，CkGA2OX，CkCO，CkFLC和CkAP1 5個基因在寒蘭開花過程呈現顯著差異及規律的表達模式，表明其與寒蘭開花密切相關。為研究AP1基因功能，我們採用瞬時表達和穩定表達兩種系統。瞬時表達試驗發現，CkAP1蛋白定位在細胞核上，而酵母單雜交試驗表明該基因編碼的蛋白單獨作用時，不具有轉錄激活活性。我們將基因的編碼框插入到雙元載體1301-220中，再通過農桿菌介導，將構建好的超表達載體轉化擬南芥。經過抗性培養基篩選，GUS染色，RT-PCR檢測，鑑定出19個擬南芥轉基因株系，轉基因T3代用於功能分析。我們發現，無論在長日照還是短日照條件下，轉基因植株的花期明顯提前，對4個擬南芥開花基因表達的定量分析表明，FT, LFY等多個開花促進因子表達量上升。 項目執行期間，課題組共培養研究生3名，發表標註該基金資助論文4篇，其中SCI論文2篇，CSCD核心1篇，另有1篇已投至molecular breeding，申請國家發明專利2項。