《基於應拉木形成的基因篩選與功能解析》是依託華南農業大學，由黃少偉擔任項目負責人的面上項目。
基本介紹
- 中文名：基於應拉木形成的基因篩選與功能解析
- 項目類別：面上項目
- 項目負責人：黃少偉
- 依託單位：華南農業大學
項目摘要,結題摘要,
項目摘要
應拉木是一種非正常的、髓心偏向一側的木材，內層是特殊的膠質層。近年來，由於其特殊的化學成分- - 纖維素含量升高、而半纖維素、木質素含量下降，成為研究植物細胞壁合成的模式材料。本研究通過對應拉木與正常直立木表達水平差異的比較研究，篩選獲得了684個差異較大的基因，在此基礎上，進一步通過表達水平的驗證和擬南芥同源基因的分析，共篩選了120個候選基因。利用反向遺傳學原理，通過從擬南芥中心獲得相對應基因的T-DNA插入突變體，進行突變體鑑定，細胞壁組分分析、希望從擬南芥中篩選到5-10個候選基因，並對其進行進一步的功能分析等。在此基礎上，在楊樹中挑選2-4個候選基因，通過RNAi來下調楊樹中的目標基因，鑑定這些轉基因楊樹的生長、材性及細胞壁組分的變化。本項目的研究不僅可以豐富我們對植物次生生長調控機理的了解，還將為林木生物質能源的開發與利用尋找到新的資源與材料。
結題摘要
對源於組織培養的1年生楊樹應拉木和正常木，將莖的橫切片分幾個不同區，其中應拉木分6個區，正常木分3個區。分區的標準是根據細胞壁的沉積厚度，從0-250um區，正常木和應拉木的細胞壁沉積速度相似，然後應拉木細胞壁沉積明顯高於正常木。其中莖270um處是應拉木膠質層（G-layer）形成的關鍵節點，在這個節點向內，半纖維素和木質素的含量會明顯下降，因而在這個關鍵節點上基因表達譜的差異變化會是我們關注的重點。接著將提取的RNA與楊樹基因晶片雜交，分析比較應拉木和正常楊樹多個不同部位基因表達水平的差異，特別是在膠質層形成節點表達水平的差異。結果表明已知與木質纖維素合成相關的PAL, C4H, F5H、FRA8等基因在膠質層形成節點前上升、膠質層形成節點後下降證明了我們的應拉木晶片結果的可靠性。然後我們將表達水平上升和下降了0.5倍以上的基因全部挑選出來，共篩選到684個楊樹基因作為候選基因。接著利用生物信息學比對，我們對候選基因找到它們在擬南芥中所對應的基因。根據擬南芥資料庫和我們實驗室的擬南芥不同組織表達資料庫，篩選在莖部高表達的基因，剔除已經發表的、功能明確的影響纖維素和木質素合成的基因，最後共篩選獲得在擬南芥莖中高表達的115個基因。從擬南芥salk研究中心訂大約110個基因相對應的T-DNA插入。利用PCR進行鑑定，我們共獲得78個純合體，並觀察植物的生長情況。在培養箱中生長8周，切取3cm長度的莖，凍乾後，用震盪機打成粉末，利用GC-MS Prolysis儀器，進行細胞壁化學組分差異快速分析。初步分析篩選，我們獲得了ERF74、ERF97、bHLH111、UXS3、UGD2等7個可能影響細胞壁中半纖維素和木質素合成或調控木質纖維素合成的基因。利用自身啟動子的顯性抑制技術，我們發現ERF74、ERF97均能影響植物的生長，植物的葉色加深，目前正在對這些基因進行定位以及功能的進一步分析。最後，我們在楊樹中驗證了這些基因的表達量，結果表明這些基因的楊樹同源基因序列也在莖部表達高表達，用對這些基因在正常楊樹和應拉木中的表達分析表明它們在應拉木中高表達。我們設計了楊樹中3個ERF等轉錄因子的顯性抑制載體，轉化了毛果楊，利用抗性篩選，已經獲得了轉基因植株；同時我們對UXS3的保守區設計了RNAi載體，也轉化了楊樹，我們將對轉基因楊樹做進一步分析。
