《基於微環境調控的產多殺菌素刺糖多孢菌代謝機制研究》是依託天津大學，由盧文玉擔任項目負責人的面上項目。
基本介紹
- 中文名：基於微環境調控的產多殺菌素刺糖多孢菌代謝機制研究
- 項目類別：面上項目
- 項目負責人：盧文玉
- 依託單位：天津大學
項目摘要,結題摘要,
項目摘要
本申請根據刺糖多孢菌基因組注釋信息，建立包含多殺菌素合成途徑和中心碳代謝途徑的局部代謝網路；過表達多殺菌素合成途徑部分基因，包括：gtt、gdh基因，gtt、gdh基因和起始組件（Loading module）SpnA基因，gtt、gdh和SpnN-SpnS基因，得到一系列具有不同多殺菌素產量、胞內外氧化還原環境（ORP）和胞內輔酶A（CoA）水平的工程菌；利用網路模型分別計算各株菌在不同胞外ORP下的通量分布，結合RT-PCR技術和代謝組學技術分析網路中特定基因的表達水平及代謝物水平，綜合實驗數據，探究不同菌株之間多殺菌素產量、胞內外ORP、CoA水平、代謝通量分布和特定基因表達水平及代謝物水平之間的相互關係，闡明胞內輔因子水平與多殺菌素合成的調控機制，最終建立定量關係模型。在此基礎上，理性設計基因工程菌，開展發酵技術最佳化研究。獲得具有我國自主智慧財產權的高產多殺菌素基因工程菌及發酵技術。
結題摘要
根據刺糖多孢菌基因組注釋信息，建立了包含多殺菌素合成途徑和中心碳代謝途徑的局部代謝網路；利用FBA算法，模擬計算了添加NADH及NADPH對刺糖多孢菌多殺菌素合成及菌體生長的影響，並分析了不同轉氫酶條件下刺糖多孢菌胞內通量分布；利用魯棒性分析方法，研究了轉氫酶活性對多殺菌素合成速率的影響，確定轉氫酶基因改造靶點,並構建基因工程菌，工程菌發酵顯示多殺菌素產量較原始菌提高了86.5%, 驗證了模型預測的準確性；通過過表達多殺菌素次級合成途徑關鍵限速基因，spnP，spnO，spnN，spnQ，spnR，spnS，spnK，gtt，gdh 和kre，使多殺菌素的產量達到405mg/L，較原始菌產量提高了近五倍；採用代謝組學的研究平台，以野生刺糖多孢菌WT作為對照，對誘變和代謝工程改造得到的兩株高產菌WH124和LU104進行了代謝物組層面的對比和分析。對檢測的數據進行主成分分析和聚類分析結果表明，WH124在發酵初期大量的代謝中間物，如中心碳代謝中間體，胺基酸等初級中間代謝物的水平較高，WT次之，而在LU104中這些化合物水平最低。這反映出WH124和LU104在提高多殺菌素合成方面的機制是不同的；通過外源脂肪酸添加、改變胞外氧化還原電勢（ORP）策略改變刺糖多孢菌發酵微環境，從相關基因表達水平、酶活水平及關鍵胞內代謝物濃度水平研究了微環境對多殺菌素合成的調控代謝機制：外源脂肪酸添加實驗表明，多殺菌素合成途徑基因轉錄上調，乙醯輔酶A和丙二酸單醯輔酶A的濃度增加，是導致多殺菌素產量的提高的主要原因；高的胞外氧化電勢，改變了胞內NADH/NAD+水平，進而影響了其感受基因rex的表達，rex基因的表達水平影響了中心碳代謝途徑、電子傳遞系統以及其他與之相關的代謝物水平，進而綜合影響了多殺菌素的合成水平。以上研究，對未來開展多殺菌素高效合成菌株理性構建具有重要意義。
