圓二色光譜(簡稱CD)是套用最為廣泛的測定蛋白質二級結構的方法，是研究稀溶液中蛋白質構象的一種快速、簡單、較準確的方法。它可以在溶液狀態下測定，較接近其生理狀態。而且測定方法快速簡便，對構象變化靈敏，所以它是目前研究蛋白質二級結構的主要手段之一，並已廣泛套用於蛋白質的構象研究中。
基本介紹
- 中文名：圓二色光譜
- 外文名：circular dichroism
- 釋義：測定蛋白質二級結構的方法
- 方法的特性：快速、簡單、較準確
- 簡稱：CD
- 橢圓率θ：θ= tg- 1 短軸/長軸
簡介,樣品要求,譜頻寬度,原理,
簡介
用於推斷非對稱分子的構型和構象的一種旋光光譜。光學活性物質對組成平面偏振光的左旋和右旋圓偏振光的吸收係數(ε)是不相等的，εL≠εR，即具有圓二色性。如果以不同波長的平面偏振光的波長λ為橫坐標，以吸收係數之差Δε=εL-εR為縱坐標作圖，得到的圖譜即是圓二色光譜，簡稱CD。如果某手性化合物在紫外可見區域有吸收，就可以得到具有特徵的圓二色光譜。由於εL≠εR，透射光不再是平面偏振光，而是橢圓偏振光，摩爾橢圓度[θ]與Δε的關係為：[θ]=3300Δε。圓二色譜也可以摩爾橢圓度為縱坐標，以波長為橫坐標作圖。由於△ε有正值和負值之分，所以圓二色譜也有呈峰的正性圓二色譜和呈谷的負性圓二色譜。在紫外可見光區域測定圓二色譜與旋光譜，其目的是推斷有機化合物的構型和構象。
樣品要求
1、樣品必須保持一定的純度不含光吸收的雜質，溶劑必須在測定波長沒有吸收干擾;樣品能完全溶解在溶劑中, 形成均一透明的溶液。
2、氮氣流量的控制
3、緩衝液、溶劑要求與池子選擇：緩衝液和溶劑在配製溶液前要做單獨的檢查，看是否在測定波長範圍內有吸收干擾， 看是否形成沉澱和膠狀；在蛋白質測量中，經常選擇透明性極好的磷酸鹽作為緩衝體系。
4 樣品濃度與池子選擇
樣品不同，測定的圓二色光譜範圍不同，對池子大小(光徑)的選擇和濃度的要求也不一樣。蛋白質CD光譜測量一般在相對較稀的溶液中進行。
譜頻寬度
選為1 nm。對於高解析度測量，要用較窄的狹縫寬度，此時光電倍增管的電壓較高，譜的信噪比差。雖然對於正常測量最佳譜頻寬度是1~2 nm，但是在下列情況下要犧牲解析度而需要較寬的狹縫寬度。當樣品的吸光度很高但CD信號很弱時，一方面要儘量保證測定CD峰所需要的足夠濃度，另一方面要設定較寬的狹縫。不過此時要特別小心，因為樣品在吸光度過高(A>2)的情況下可能存在螢光或雜散光引起的某些假象。另外，在固體CD光譜測試時也需要較大的狹縫寬度(一般要求 > 2 nm)。
(2)橢圓率和摩爾橢圓率都依賴於測量條件。因此，溫度、波長和樣品濃度總是應該特別註明的。
(3) 當用壓片法或石蠟油研磨法進行固體粉末樣品測試時，要儘可能地研磨獲得細小均勻的樣品顆粒。採用石蠟油糊方法時，必須注意某些憎水有機化合物可能溶於石蠟油中，這時所得CD光譜在某種意義上應視為溶液CD光譜。採用壓片法測試固體CD時，在保證手性樣品的定性濃度達到CD光譜儀檢測要求的同時，片越薄越透明越好(但切忌破損)。在某些情況下，壓片法不適用於手性抗衡陰離子存在下的固體誘導CD光譜的測定。
使用壓片機須注意：
① FW-4型壓片機極限壓力24噸，對應壓力表讀數37.5 MP，超過此極限容易損壞機器，請不要隨意加壓。
② 一般用途的壓片，加壓至8噸(12.5 MP)即可，當KBr(或KCl)用量約50 mg時能獲得較光滑均勻的片膜。
③ 使用壓片機時如感覺壓油手柄有壓力，而壓力表讀數為0，請立即旋鬆油閥，檢查壓力表是否損壞。
④ 機器放置一段時間未使用，在使用前可旋緊放油閥，加壓至15 MP，再旋鬆放油閥。如此反覆幾次，即可正常使用。
⑤ 壓片完成後，請用棉花蘸取少量酒精將壓片模具和研缽洗乾淨，置於紅外燈下烘乾後再將壓片模具放回乾燥器中。壓片剩餘的固體粉末和使用過的棉花倒入垃圾桶中。
(4) 在紫外區進行光譜掃描時，J-810型CD光譜儀的耗氮量為：3 L/min(190~400 nm)；3~5 L /min(185 nm)；10 L/min(180 nm)；30~50 L/min(175 nm)；60~70 L/min(170 nm)。因此當測定蛋白等樣品的遠紫外光譜時，必須增加氮氣的流量，以避免臭氧對紫外光產生的吸收干擾光譜的測定。
(5) 對獲取理想的溶液或固體CD譜圖的建議：
① 手性樣品符合CD光譜測試的條件(在給定波長範圍內有較強的CD信號和合適的吸收值)。必須事先測定手性樣品的UV-Vis吸收光譜(溶液或固體漫反射)，預測CD譜峰的可能位置和選擇合適的制樣濃度(對於溶液吸收光譜，A ≈ 1)。
② 提供高對映純度的手性樣品。
③ 根據樣品的性質選擇測定方式(溶液、固體、單晶或螢光CD)。
④ 對溶液樣品應選用合適的溶劑(見附表)、濃度和光程(與測定UV-Vis光譜類似)。對於在紫外區測試的樣品建議選用較小的光程(≤0.5 cm)和截止波長足夠低的溶劑，最好為高純水或醇類溶劑(見附表)。
⑤ 對固體樣品的壓片法測試，應視樣品的不同選用合適百分比濃度及合適的稀釋劑( KBr、KCl或 CsI 等)研磨壓片後進行透射掃描。
⑥ 選擇適當的測定參數(波長範圍、掃描速度、靈敏度和狹縫等)。
⑦ 對於同一個樣品，在可能的條件下，建議同時做其溶液和固體CD光譜加以比較。
⑧ 如果可能，最好同時做一對對映體的CD光譜，以檢查其CD信號的真偽和在定量的條件下互相印證其對映純度。
(2)橢圓率和摩爾橢圓率都依賴於測量條件。因此，溫度、波長和樣品濃度總是應該特別註明的。
(3) 當用壓片法或石蠟油研磨法進行固體粉末樣品測試時，要儘可能地研磨獲得細小均勻的樣品顆粒。採用石蠟油糊方法時，必須注意某些憎水有機化合物可能溶於石蠟油中，這時所得CD光譜在某種意義上應視為溶液CD光譜。採用壓片法測試固體CD時，在保證手性樣品的定性濃度達到CD光譜儀檢測要求的同時，片越薄越透明越好(但切忌破損)。在某些情況下，壓片法不適用於手性抗衡陰離子存在下的固體誘導CD光譜的測定。
使用壓片機須注意：
① FW-4型壓片機極限壓力24噸，對應壓力表讀數37.5 MP，超過此極限容易損壞機器，請不要隨意加壓。
② 一般用途的壓片，加壓至8噸(12.5 MP)即可，當KBr(或KCl)用量約50 mg時能獲得較光滑均勻的片膜。
③ 使用壓片機時如感覺壓油手柄有壓力，而壓力表讀數為0，請立即旋鬆油閥，檢查壓力表是否損壞。
④ 機器放置一段時間未使用，在使用前可旋緊放油閥，加壓至15 MP，再旋鬆放油閥。如此反覆幾次，即可正常使用。
⑤ 壓片完成後，請用棉花蘸取少量酒精將壓片模具和研缽洗乾淨，置於紅外燈下烘乾後再將壓片模具放回乾燥器中。壓片剩餘的固體粉末和使用過的棉花倒入垃圾桶中。
(4) 在紫外區進行光譜掃描時，J-810型CD光譜儀的耗氮量為：3 L/min(190~400 nm)；3~5 L /min(185 nm)；10 L/min(180 nm)；30~50 L/min(175 nm)；60~70 L/min(170 nm)。因此當測定蛋白等樣品的遠紫外光譜時，必須增加氮氣的流量，以避免臭氧對紫外光產生的吸收干擾光譜的測定。
(5) 對獲取理想的溶液或固體CD譜圖的建議：
① 手性樣品符合CD光譜測試的條件(在給定波長範圍內有較強的CD信號和合適的吸收值)。必須事先測定手性樣品的UV-Vis吸收光譜(溶液或固體漫反射)，預測CD譜峰的可能位置和選擇合適的制樣濃度(對於溶液吸收光譜，A ≈ 1)。
② 提供高對映純度的手性樣品。
③ 根據樣品的性質選擇測定方式(溶液、固體、單晶或螢光CD)。
④ 對溶液樣品應選用合適的溶劑(見附表)、濃度和光程(與測定UV-Vis光譜類似)。對於在紫外區測試的樣品建議選用較小的光程(≤0.5 cm)和截止波長足夠低的溶劑，最好為高純水或醇類溶劑(見附表)。
⑤ 對固體樣品的壓片法測試，應視樣品的不同選用合適百分比濃度及合適的稀釋劑( KBr、KCl或 CsI 等)研磨壓片後進行透射掃描。
⑥ 選擇適當的測定參數(波長範圍、掃描速度、靈敏度和狹縫等)。
⑦ 對於同一個樣品，在可能的條件下，建議同時做其溶液和固體CD光譜加以比較。
⑧ 如果可能，最好同時做一對對映體的CD光譜，以檢查其CD信號的真偽和在定量的條件下互相印證其對映純度。
原理
光是橫電磁波，是一種在各個方向上振動的射線。其電場矢量E 與磁場矢量H 相互垂直，且與光波傳播方向垂直。由於產生感光作用的主要是電場矢量，一般就將電場矢量作為光波的振動矢量。光波電場矢量與傳播方向所組成的平面稱為光波的振動面。若此振動面不隨時間變化，這束光就稱為平面偏振光，其振動面即稱為偏振面。平面偏振光可分解為振幅、頻率相同，旋轉方向相反的兩圓偏振光。其中電矢量以順時針方向旋轉的稱為右旋圓偏振光，其中以逆時針方向旋轉的稱為左旋圓偏振光。兩束振幅、頻率相同，旋轉方向相反的偏振光也可以合成為一束平面偏振光。如果兩束偏振光的振幅(強度) 不相同,則合成的將是一束橢圓偏振光。
光學活性物質對左、右旋圓偏振光的吸收率不同,其光吸收的差值ΔA ( Al - Ad) 稱為該物質的圓二色性(circular dichroism ,簡寫作CD) 。圓二色性的存在使通過該物質傳播的平面偏振光變為橢圓偏振光,且只在發生吸收的波長處才能觀察到。所形成的橢圓的橢圓率θ為:θ= tg- 1 短軸/長軸
根據Lambert-Beer 定律可證明橢圓率近似地為：θ= 0. 576 lc (εl - εd) = 0. 576 lcΔε 公式中l 為介質厚度, c 為光活性物質的濃度,εl 及εd分別為物質對左旋及右旋圓偏振光的吸收係數。測量不同波長下的θ(或Δε) 值與波長λ之間的關係曲線,即圓二色光譜曲線。在此光譜曲線中,如果所測定的物質沒有特徵吸收,則其Δε值很小,即得不到特徵的圓二色光譜。當εl >εd 時,得到的是一個正的圓二色光譜曲線,即被測物質為右旋,如果εl <εd ,則得到一個負的圓二色光譜曲線,即被測物質為左旋。
根據圓二色光譜法的原理和測試要求設計製成的儀器稱為圓二色光譜儀。目前圓二色光譜法及其儀器已廣泛套用於有機化學、生物化學、配位化學和藥物化學等領域,成為研究有機化合物的立體構型的一個重要方法。
光學活性物質對左、右旋圓偏振光的吸收率不同,其光吸收的差值ΔA ( Al - Ad) 稱為該物質的圓二色性(circular dichroism ,簡寫作CD) 。圓二色性的存在使通過該物質傳播的平面偏振光變為橢圓偏振光,且只在發生吸收的波長處才能觀察到。所形成的橢圓的橢圓率θ為:θ= tg- 1 短軸/長軸
根據Lambert-Beer 定律可證明橢圓率近似地為：θ= 0. 576 lc (εl - εd) = 0. 576 lcΔε 公式中l 為介質厚度, c 為光活性物質的濃度,εl 及εd分別為物質對左旋及右旋圓偏振光的吸收係數。測量不同波長下的θ(或Δε) 值與波長λ之間的關係曲線,即圓二色光譜曲線。在此光譜曲線中,如果所測定的物質沒有特徵吸收,則其Δε值很小,即得不到特徵的圓二色光譜。當εl >εd 時,得到的是一個正的圓二色光譜曲線,即被測物質為右旋,如果εl <εd ,則得到一個負的圓二色光譜曲線,即被測物質為左旋。
根據圓二色光譜法的原理和測試要求設計製成的儀器稱為圓二色光譜儀。目前圓二色光譜法及其儀器已廣泛套用於有機化學、生物化學、配位化學和藥物化學等領域,成為研究有機化合物的立體構型的一個重要方法。
