《固定化功能蛋白質取向及構象表征和調控色譜新方法》是依託西北大學，由趙新鋒擔任項目負責人的青年科學基金項目。
基本介紹
- 中文名：固定化功能蛋白質取向及構象表征和調控色譜新方法
- 項目類別：青年科學基金項目
- 項目負責人：趙新鋒
- 依託單位：西北大學
項目摘要,結題摘要,
項目摘要
針對固定化蛋白質色譜固定相表面蛋白質分子取向及構象尚不清楚的問題，以G-蛋白偶聯受體超家族成員Beta2-腎上腺素受體（Beta2-AR）為例，以能分別特異性結合Beta2-AR全長基因、N末端和C末端結構域的3種免疫抗體為該受體的構象探針，利用其與受體結合強度與受體構象變化定量相關的特性，用前沿分析法研究離子強度、溫度和pH等因素對3種抗體在Beta2-AR色譜固定相上容量因子、結合常數和熱力學參數的影響，獲得其與受體構象變化的定量關係，建立固定化受體取向及構象表征色譜新方法。在此基礎上，以沙丁胺醇等6種配體為工具藥，研究配體對固定化受體與抗體結合強度的影響及其濃度依賴關係，建立固定化受體取向及構象梳理和調控策略及方法，為功能蛋白質取向及構象的調控研究奠定基礎，對以固定化功能蛋白質為核心的藥物與蛋白質相互作用及藥物活性成分篩選新方法具有理論意義。
結題摘要
本研究以G-蛋白偶聯受體超家族成員Beta2-腎上腺素受體（Beta2-AR）為例，建立了基於重氮鹽反應的His標籤重組Beta2-AR定向固定化方法。該方法可推廣至其他His標籤融合蛋白質的定向固定化。項目組還引入了綠色螢光蛋白（GFP），建立了蛋白質固定化工藝及表面形態表征方法，解決了固定化功能蛋白質表面形態表征難的問題。進一步採用重氮鹽方法製備了定向固定化Beta2-AR色譜固定相，建立了固定化Beta2-AR親和色譜方法。針對經典親和色譜中前沿分析和競爭置換分析方法的不足，推導獲得了測定藥物-蛋白質和蛋白質-蛋白質相互作用的理論公式。該理論以進樣量和溶質的容量因子為變數，克服了前沿分析和競爭置換分析法配體用量大和分析時間長等不足。分別採用競爭置換法和項目所得理論公式對GFP抗體與固定化GFP，三種Beta2-AR抗體與固定化Beta2-AR的相互作用，證明直接進樣法所得結合常數更接近文獻免疫共沉澱方法的結果。本研究還發現作用於Beta2-AR全長基因的抗體在固定化Beta2-AR色譜固定相上的保留弱於作用於N末端和C末端結構域的抗體。三種抗體中，作用於N-末端結構域的抗體在固定化Beta2-AR色譜柱上的保留最強。上述研究表明，抗體可作為構象探針，定性表征固定化功能蛋白質的構象。項目組以作用於N末端結構域的抗體為構象探針，研究了溫度、離子強度和流動相pH對抗體與固定化Beta2-AR結合常數的影響，發現溫度對其影響較大。最後，以麻黃鹼和偽麻黃鹼的混合溶液為進樣溶質，分別以添加有不同濃度麻黃鹼和偽麻黃鹼的磷酸鹽緩衝溶液為流動相，研究了不同溫度及配體添加濃度對麻黃鹼和偽麻黃鹼在固定化Beta2-AR色譜柱上分離度的影響，證明配體和溫度為影響固定化受體構象的關鍵因素，可用於建立固定化功能蛋白質構象調控方法。綜上，本研究解決了固定化功能蛋白質構象無表征和調控方法的問題，對於以固定化蛋白質為核心的生物感測器、親和色譜及酶聯免疫試劑盒的研究具有重要意義，有望促進分析化學相關學科的發展。本項目共發表科研論文12篇，其中SCI收錄7篇，研究成果被Drug Discovery Today （IF=6.890）編輯Hubertus Irth和Journal of Chromatography B（IF2.888）主編David S. Hage分別進行了重要評述。
