《嗜鹽古菌胞外蛋白酶分泌機制的研究》是依託武漢大學，由唐曉峰擔任項目負責人的面上項目。
基本介紹
- 中文名：嗜鹽古菌胞外蛋白酶分泌機制的研究
- 項目類別：面上項目
- 項目負責人：唐曉峰
- 依託單位：武漢大學
項目摘要,結題摘要,
項目摘要
嗜鹽古菌細胞通過Tat途徑分泌摺疊好的胞外蛋白質，可避免胞外苛刻的環境因子對蛋白質摺疊造成不利影響，被認為是嗜鹽古菌適應極端環境的一個重要策略。但是對蛋白酶而言，如果它們在胞內摺疊好後通過Tat途徑分泌，在分泌之前有可能釋放活性降解胞內具有重要生物學功能的蛋白質，從而對細胞生長造成危害，嗜鹽古菌胞外蛋白酶的分泌機制及細胞在其中所發揮的調控作用仍然是未解之謎。我們在前期工作中通過實驗證實嗜鹽古菌Natrinema sp. J7的一種胞外蛋白酶為Tat途徑的底物，最近，J7菌株的基因組的測序工作已完成。在上述工作基礎上，本項目以J7中具有Tat特徵信號肽序列的5種胞外蛋白酶為研究對象，確定它們的分泌途徑，闡明嗜鹽古菌胞外蛋白酶分泌與活性釋放的細胞調控方式，為揭示極端嗜鹽古菌的蛋白質分泌機制及其適應機理提供新的理論依據。
結題摘要
我們首先完成了嗜鹽古生菌Natrinema sp. J7-2全基因組的測定，J7-2是第一個完整測定基因組的Natrinema屬菌株。Natrinema sp. J7-2的基因組由3,697,626-bp的染色體和一個95, 989-bp 的質粒pJ7-I組成。以往嗜鹽古生菌基因組分析結果表明，儘管嗜鹽古生菌同時具備Tat和Sec分泌系統，但它們廣泛採用Tat 途徑分泌胞外蛋白，這被認為是嗜鹽古生菌在分泌機制方面不同於其他古生菌和細菌的獨特之處。為了探究Tat和Sec分泌系統在嗜鹽古生菌胞外蛋白分泌過程中的作用，我們在菌株J7-2基因組分析的基礎上，利用RPLC-ESI-MS/MS質譜技術對該菌分泌的胞外蛋白和膜蛋白進行了研究。結果顯示，通過質譜技術所檢測到的分泌蛋白質的種類和數量遠少於基因組的預測結果。總共檢測到48個具Tat信號肽的蛋白（Tat底物），20個具Sec信號肽的蛋白（Sec底物）和3個III型分泌系統的蛋白，64%的Tat底物主要為具有Lipobox結構的脂蛋白，大多數為胞外溶質結合蛋白和氧化還原蛋白等。膜組分中的Sec底物主要為含有多個跨膜區的膜蛋白，這顯示Sec信號肽在膜蛋白的定位過程中發揮重要作用。 我們將菌株J7-2的胞外蛋白酶SptA（Tat信號肽）和SptE（Sec信號肽）基因進行克隆和表達，並對這兩種蛋白酶進行了信號肽替換以觀察不同信號肽對這兩個蛋白分泌的影響。結果表明：將SptA的Tat信號肽替換為Sec信號肽後，在重組菌培養物胞外上清及細胞表面均未檢測到蛋白酶活性；當SptE的Sec信號肽替換為Tat信號肽後，在培養物細胞表面能夠檢測到蛋白酶活性。表明嗜鹽古生菌的Tat系統不僅可以分泌摺疊蛋白，也具有分泌去摺疊蛋白的能力。我們也對SptA的成熟加工過程進行了初步研究。本工作為揭示極端嗜鹽古菌的蛋白質分泌機制及其適應機理提供新的理論依據。
