單細菌水平毒素－抗毒素系統研究新方法

《單細菌水平毒素－抗毒素系統研究新方法》是依託廈門大學，由吳麗娜擔任項目負責人的面上項目。

基本介紹

• 中文名：單細菌水平毒素－抗毒素系統研究新方法
• 項目類別：面上項目
• 項目負責人：吳麗娜
• 依託單位：廈門大學

項目摘要

毒素－抗毒素（TA）系統幾乎存在於所有致病菌中，它的異質性表達產生多藥耐藥的休眠存留細胞。對單細菌體內的毒素－抗毒素蛋白進行快速的逐一分析可揭示因集權平均而被掩蓋的個體差異，有益於TA系統的異質性考察及亞類表征。本申請擬利用實驗室自行研製的超高靈敏流式檢測裝置的靈敏、快速、多參數分析性能，結合四半胱氨酸－雙砷染料體系的蛋白標記優點，通過對單個細菌散射光和螢光信號的同時檢測，發展TA系統研究新方法，建立單個細菌體內毒素、抗毒素蛋白定量表征技術並考察各參數之間的相互關係；建立TA系統應激檢測模式，確定TA系統在誘發細菌程式性阻滯和程式性死亡中的作用；引入Two-Step Cascade調控機制，考察TA系統間互動作用並發展方便、快捷的毒素蛋白誘導因子篩選法。本研究將創立單細菌水平、原位、高通量、普適性的TA系統研究新方法，對揭示TA系統的作用機理和研究對抗致病菌及細菌耐藥性的戰略具有重要價值。

結題摘要

毒素－抗毒素（TA）系統幾乎存在於所有致病菌中，它的異質性表達產生多藥耐藥的存留細胞。對單細菌體內的毒素－抗毒素蛋白進行快速的逐一分析可揭示因集權平均而被掩蓋的個體差異。本項目通過對單個細菌散射光、毒素和抗毒素蛋白的雙螢光信號的同時檢測，發展TA系統研究新方法，建立單個細菌體內毒素、抗毒素蛋白定量表征技術並考察T/A比例與各參數之間的相互關係；建立TA系統應激檢測模式，確定TA系統在細菌生長中的作用；考察TA系統間互動作用並發展方便、快捷的毒素蛋白誘導因子篩選法。取得的重要進展如下： 1、構建由天然啟動子調控的帶標籤TA系統。在原計畫成功構建攜帶四半胱氨酸標籤的TA系統的基礎上分別在毒素和抗毒素蛋白上新增構建His-tag和Flag-tag融合標籤。結合雙砷染色和免疫螢光染色方法，實現對毒素和抗毒素蛋白的同時檢測。 2、建立單細菌水平TA系統蛋白表達的超高靈敏流式檢測方法。首次在單細菌水平觀測到表達量極低的毒素蛋白MqsR的表達。發現在正常生長條件下，細菌存在高表達和低表達抗毒素MqsA兩個群體，在抑制細菌生長的條件下，高表達的MqsA被降解。 3、建立應激條件下單細菌水平毒素、抗毒素蛋白表達的超高靈敏流式分析方法。發現抗毒素MqsA在氧化應激時被降解，在熱應激時持續合成，在胺基酸飢餓時被降解後再生（首次發現）。 4、建立抗毒素MqsA蛋白與細菌生長同時檢測的超高靈敏流式分析方法。發現抗毒素MqsA蛋白表達與細菌生長呈正相關，且細菌生長不管是抑制還是促進都比MqsA蛋白反應滯後60 min。 5、 實現了單細菌水平Lon蛋白酶調控MqsR/MqsA TA系統的超高靈敏檢測，初步建立了TA系統互動作用的超高靈敏流式研究方法。 6、建立持留菌形成過程中單細菌水平T/A比例的監測方法，獲得T/A比例與細菌耐藥相關持留菌形成的關係。 7、此外，以重組噬菌體PPO1-TC及E. coli O157:H7作為模型，建立痕量致病活菌的靈敏、特異、快速檢測體系。 (Biosens Bioelectron., 2016，86, 102-108) 8、 建立了可以對蛋白質相互作用進行檢測和強度排序對比的定量蛋白相作用研究新方法。（Anal. Chem., 2017, 89, 2782-2789）