單細胞表面ATP釋放原位動態檢測分析系統研究

《單細胞表面ATP釋放原位動態檢測分析系統研究》是依託浙江大學，由梁波擔任項目負責人的青年科學基金項目。

基本介紹

• 中文名：單細胞表面ATP釋放原位動態檢測分析系統研究
• 依託單位：浙江大學
• 項目負責人：梁波
• 項目類別：青年科學基金項目

項目摘要

細胞表面ATP釋放在神經信息調節、機體發育與內平衡調控、細胞凋亡與腫瘤細胞清除等生理過程中發揮重要作用，然而細胞ATP釋放機制及調控機理尚不明確，進一步研究必將從行為學和組織學層面向單細胞層面深入。因此，對單細胞表面ATP釋放進行原位動態檢測分析研究具有重要意義。本項目針對當前單細胞表面ATP釋放動態監測困難、檢測精度不高、時間解析度低等問題，探索基於分級嵌套微納孔洞陣列的高靈敏高回響電化學生物感測電極製備與修飾方法，研製集單細胞定點培養、微流體流動注射、ATP原位快速檢測於一體的單細胞表面ATP釋放檢測分析系統，為單細胞ATP釋放動力學過程與釋放機制研究提供技術基礎，並在此基礎上以神經膠質細胞為實驗模型開展關於單細胞ATP釋放機制以及凋亡腫瘤細胞ATP釋放與調控等方面的研究與探索。本項目研究對神經信息學領域信息遞質釋放與調控機理認知，細胞凋亡調控與癌症免疫等方面的研究發展具有重要價值。

結題摘要

三磷酸腺苷（ATP）除了為機體提供能量來源之外，作為信息遞質，在神經信息調節、機體內平衡調控、細胞凋亡、腫瘤細胞清除等方面具有重要的生理意義，而其釋放機制及調控機理尚不明確。因此對單細胞表面ATP釋放進行原位動態檢測分析研究具有極其重要的意義。 本項目基於電流型電化學檢測的方法，採用葡萄糖氧化酶/己糖激酶的雙酶體系，通過測量H2O2電化學回響電流的變化測得ATP的濃度。主要研究內容包括電化學絲網印刷電極研究、針狀微電極研究、單一平面微電極研究、平面微電極陣列研究、細胞培養與檢測等五個部分內容。提高ATP酶生物感測器的靈敏度和回響速度，是單細胞ATP釋放實時監測和分析研究得以實現的關鍵技術，也是本研究的核心。研究中涉及的主要關鍵技術點有酶的固定化、電極的微型化和細胞水平的檢測。 在電化學絲網印刷電極研究中，成功檢測出ATP信號，通過參數最佳化將檢測靈敏度提升至20.1 μA mM-1 cm-2，並達到1 μM檢測限。在直徑為50 μm鉑絲針狀微電極研究中，靈敏度可達50 nA/mM。在單一平面微電極研究中，採用可重複打磨使用的直徑為12.5 μm的微金圓盤電極，靈敏度達40 pA/mM。在平面微電極陣列研究中，增加了金-鉑複合微結構修飾層，靈敏度達130.59 nA mM-1，檢測限降至20 μM。在細胞培養與檢測研究中，初步選取SK-HEP-1細胞培養於平面微電極上方，位於細胞下方的被修飾過的電極可直接檢測到從上方細胞中釋放出來的ATP。 本項目研究提出了一種可實時監測細胞釋放ATP的分析測試平台和技術路線，為細胞釋放ATP的機理研究提供了平台。該成果可擴展至其他細胞分泌物釋放的實時檢測中，如乳酸、多巴胺、NAD+、活性氧、Ca2+、microRNA、胺基酸等等，為研究其機理提供了強有力的技術支撐。該成果還可用於腫瘤細胞分泌物檢測上，為深入探究細胞凋亡和腫瘤細胞清除等生理過程提供依據。該實驗平台還能和光學檢測相結合，在針對弱信號檢測的課題研究中，發揮聯合檢測的優勢。