《哈氏噬纖維素菌獨特纖維素酶的研究》是依託山東大學，由陳冠軍擔任項目負責人的面上項目。
基本介紹
- 中文名：哈氏噬纖維素菌獨特纖維素酶的研究
- 項目類別：面上項目
- 項目負責人：陳冠軍
- 依託單位：山東大學
中文摘要,結題摘要,
中文摘要
好氧噬纖維菌具有極強的結晶纖維素降解能力。與已經闡明的其它微生物纖維素降解模式不同，噬纖維菌具有獨特的纖維素水解代謝機制，但目前這方面的研究幾乎是個空白。本項目擬以全基因組序列已測定完成的高效結晶纖維素降解菌株Cytophaga hutchinsonii為實驗材料，對噬纖維菌的獨特纖維素酶系，尤其是膜相關纖維素酶組分進行分離鑑定，通過對底物的吸附與降解進行功能表征；通過波譜學、分子動力學和計算機模擬分析推測酶的結構與功能，通過構象和結構域的拆分與組合分析其結構與功能；在建立該菌遺傳操作體系的基礎上，深入闡述噬纖維菌獨特的纖維素降解機制，為進一步通過比較分析微生物不同的纖維素降解模式，建立發展纖維素轉化利用的新策略提供理論基礎，填補細胞結合型非複合體纖維素降機制研究的空白，豐富和發展纖維素降解的理論體系。
結題摘要
噬纖維素菌具有獨特的纖維素降解機制。本項目在實施過程中以哈氏噬纖維素菌（Cytophaga hutchinsonii）為對象開展了相關研究，取得了系列成果。（1）通過對細胞不同部位酶活性分析，表明哈氏噬纖維素菌的纖維素酶組分定位於其細胞的外膜上，纖維二糖或纖維寡糖的降解主要發生在其細胞質膜上；（2）從哈氏噬纖維素菌外膜上分離純化到CHU_1107、CHU_1075和CHU_3384三種纖維素酶組分，CHU_1107的催化結構域和CHU_1280在大腸桿菌中獲得活性表達；（3）對分離純化的和克隆表達的酶組分進行了酶學性質表征，顯示這些纖維素酶組分的底物專一性和產物譜有差異，表明不同酶組分對纖維素底物有不同的作用方式；（4）將瑞氏木霉CBHⅠ的CBM及Linker區通過基因融合PCR的方式與CHU_1107GH5的C端融合在一起，並在大腸桿菌中獲得表達，該雜合重組酶降解結晶纖維素的能力得到提高；（5）利用轉座質粒pHimarEm1和基於基因組複製原點序列的複製型質粒pLYL03C，最佳化和確定了菌體培養及電轉化的最佳條件，從而構建完善了哈氏噬纖維素菌的遺傳操作體系；（6）通過對不同碳源條件下的定量PCR檢測分析、胞內不同部位蛋白質組分的SDS-PAGE分析以及轉錄組分析，表明不同的纖維素酶組分和-葡萄糖苷酶組分受纖維素底物的誘導表達情況不同，其中纖維素酶CHU_1655的表達量最高；（7）選取了該菌中有代表性的四個纖維素酶基因（chu_1655、chu_1107、chu_1280和chu_1335）進行了單基因插入失活，結果顯示儘管引起生長延遲，但任何單一纖維素酶基因的失活突變會被其它纖維素酶基因的表達所彌補；（8）通過插入失活突變，篩選獲得了一批纖維素利用缺陷型突變株，並通過質粒拯救確定了突變的基因位點，對有代表性的CHU_1719和CHU_2981兩個未知功能的外膜蛋白的作用與功能進行了分析，顯示兩者可能參與細胞外膜蛋白的定位或組裝；（9）對與解澱粉擬桿菌中SUS（starch utilization system，澱粉利用系統）類似的chu_1276～1279基因簇的作用與功能進行了分析，初步結果顯示該基因簇編碼的蛋白組分可能參與外膜上纖維素降解結構的形成。以上結果初步揭示了哈氏噬纖維素菌的纖維素降解機制，這對後續該菌纖維素降解作用的深入研究奠定了理論和技術基礎。
