呋喃唑酮檢測試劑盒

呋喃唑酮檢測試劑盒是用來檢測動物性食品中的呋喃唑酮殘留物的。一般分為兩種，一種是水產專用試劑盒，一種是普通畜禽製品檢測試劑盒。硝基呋喃類藥物因有非常好的抗菌作用和藥動力學的特性，曾經被廣泛套用，作為禽類、水產和豬促生長的添加劑。但在長時間的實驗研究過程中發現，硝基呋喃類藥物和代謝物均可以使實驗動物發生癌變和基因突變，正因為如此才導致此類藥物禁止在治療和飼料中使用。

基本介紹

• 中文名：呋喃唑酮檢測試劑盒
• 產品類型：試劑盒

水產專用

概要

呋喃唑酮在1995年被禁用。

由於硝基呋喃類藥物在體內很快就能被代謝，而在組織中結合的代謝產物則能存留較長的一段時間，所以在分析此類藥物的殘留時經常要分析其代謝後的產物，管理部門就以檢測代謝產物為手段達到檢測硝基呋喃類殘留的目的。呋喃唑酮代謝產物AOZ；呋喃它酮代謝產物AMOZ；硝基呋喃托英代謝產物AHD；硝基糠腙（呋喃西林）代謝產物SEM。

用來檢測呋喃唑酮代謝物的最常用方法是LC-UV，LC-MS和LC-MS/MS。酶聯免疫方法結合了色譜技術，採用AOZ衍生物的特異性抗體，具有很高的精確度，更靈敏的反應，較低的操作技術要求和短暫的檢測時間，檢測樣本量大等特點在檢測中很好的表現出來。

該試劑盒可以測定水產樣本中呋喃唑酮代謝物的殘留量。

原理

本試劑盒採用間接競爭ELISA方法，在微孔條上預包被偶聯抗原，樣本中的殘留物AOZ經衍生化後和微孔條上預包被的偶聯抗原競爭抗呋喃唑酮代謝物的衍生物抗體，加入酶標二抗後，用他TMB底物顯色，樣本吸光值與其所含殘留物AOZ的含量成負相關，與標準曲線比較即可得出相應殘留物呋喃唑酮代謝物的殘留量。

試劑盒特性

試劑盒靈敏度：0.025ppb

檢測下限

蝦\魚等水產組織因存在一定的干擾，檢測下限在0.1ppb

樣本回收率

水產組織 …………………………………………… 80±15%

交叉反應率

呋喃唑酮代謝物…………………………………… 100%

呋喃它酮代謝物………………………………………＜0.01%

呋喃妥因代謝物 ……………………………………＜0.01%

硝基糠腙（呋喃西林）代謝物…………………………＜0.01%

組成

1、96孔酶標板×1塊 （包被有偶聯抗原）

2、標準液×6瓶：（1ml/瓶）

0ppb,0.025ppb,0.075ppb,0.225ppb,0.675ppb,2.025ppb

3、酶標二抗 12ml ……………………… 紅色帽

4、濃縮抗體 0.8ml ……………………… 綠色帽

5、底物液 A 液 7ml ……………………… 白色帽

6、底物液 B 液 7ml ……………………… 紅色帽

7、終 止 液 7ml ……………………… 黃色帽

8、20×濃縮洗滌液 40ml ……………………… 透明帽

9、2×濃縮復溶液 50ml…………………… 透明帽

儀器：

┅┅微孔板酶標儀450nm/630nm

┅┅勻質器

┅┅振盪器

┅┅離心機

┅┅微量移液器：單道 20ml～200ml、200ml～1000ml

多道 250ml

┅┅天平：感量0.01g

試劑：

┅┅乙酸乙酯

┅┅正己烷（或正庚烷）

┅┅K2HPO4?3H2O

┅┅2-硝基苯甲醛

┅┅甲醇

┅┅濃HCl

┅┅NaOH

樣本前處理步驟

註：樣本處理前須知

處理任何樣本時，都必須注意：

（a）實驗中必須使用一次性吸頭，在吸取不同的試劑時要更換吸頭。

（b）實驗之前須檢查各種實驗器具是否乾淨，必要時可

對實驗器具進行清潔，以避免污染干擾實驗結果。

樣本前處理需配製：

配液1：衍生化試劑 15.1mg 2-硝基苯甲醛

加甲醇10ml溶解（濃度為10mM）。

配液2：用去離子水將2×濃縮復溶液按1：1稀釋（1份濃縮復溶液+1份去離子水）用於抗體稀釋和樣本的復溶。

配液3：0.1M K2HPO4 22.8g K2HPO4?3H2O

加去離子水溶解定容至1L。

配液4：1M HCl 8.3ml 濃HCl

用去離子水定容至100ml。

配液5：1M NaOH 4g NaOH

用去離子水溶解定容至100ml。

（a）水產樣本前處理

┅┅用均質器均質樣本；

┅┅取1±0.05g的均質物（魚/蝦），分別加入4ml的蒸餾水， 0.5ml 1M HCL和100ml衍生化試劑，充分振盪；

┅┅在37 oC過夜孵育（大約16h）；

┅┅分別加入5ml 0.1M K2HPO4，0.4ml 1M NaOH和5ml乙酸乙酯，劇烈振盪30s；

┅┅在室溫下（20-25 oC/68-77℉）3000g以上離心10min；

┅┅用1ml正己烷（或正庚烷）溶解乾燥物，用1ml已稀釋好的復溶液充分混合；

┅┅取50ml下層液體用於分析。

樣本稀釋倍數：2

註：樣本應當保存在陰涼避光處並且需要冷藏保存。

酶標免疫分析程式：

測定前應須知：

1、使用之前將所有試劑和需用板條的溫度回升至室溫（20-25℃）。

2、使用之後立即將所有試劑放回2-8℃。

3、在ELISA分析中的再現性，很大程度上取決於洗板的一致性，正確的洗板操作是ELISA測定程式中的要點。

4、在所有恆溫孵育過程中，避免光線照射，用蓋板膜蓋住微孔板。

操作步驟：

1、將試劑盒從冷藏環境中取出並將所需試劑從試劑盒取出，置室溫（20-25℃）平衡30min以上, 注意每種液體試劑使用前均須搖勻。

2、配液：將40ml濃縮洗滌液（20倍濃縮）用去離子水稀釋至800ml備用（或按需量稀釋），稀釋好的洗滌液在4℃

環境可保存一個月，使用前也需回溫。

3、取出板架及需要數量的微孔板，將不用的微孔板重新密封，保存於2-8℃不要冷凍。

4、編號：將樣本和標準品對應微孔按序編號，每個樣本和標準品均需做2孔。

5、將濃縮抗體用已稀釋好的復溶液11倍稀釋（1份抗體加入10份稀釋液）。

6、加標準品/樣本50μl/孔，然後加已稀釋好的抗體50μl/孔，用蓋板膜蓋板，25℃環境中反應60min，取出用洗滌液每孔加250ml，洗板5次，每次10秒，拍乾（拍乾後未被清除的氣泡可用乾淨的槍頭刺破）。

7、顯色：每孔加入顯色劑A液50ml，再加B液50ml，輕輕振盪混勻，25℃環境中避光顯色30min。

8、測定：每孔加入終止液50ml，輕輕振盪混勻，設定酶標儀於450nm處（建議用雙波長450/630nm檢測，在5min內讀完數據），測定每孔OD值。

結果判定

1、用樣本的平均吸光度值與標準值比較即可得出其濃度範圍(µg/L)。假設樣本1的吸光度值為0.310，樣本2的吸光度值為0.820，標準液吸光度值分別是：0ppb為1.810；0.025ppb為1.520；0.075ppb為1.230；0. 225ppb為0.760； 0.675ppb為0.389；2.025ppb為0.118。則樣本1的濃度範圍是0.675ppb-2.025ppb，乘以其對應的稀釋倍數； 樣本2的濃度範圍是0.075 ppb-0.225ppb，乘以其對應的稀釋倍數。

2、定量分析

（1）百分吸光率的計算，標準品或樣本的百分吸光率等於標準品或樣本的百分吸光度值的平均值（雙孔）除以第一個標準（0標準）的吸光度值，再乘以100%，即

百分吸光度值（%）= B ×100%

B0

B—標準溶液或樣本溶液的平均吸光度值

B0—0µg/L標準溶液的平均吸光度值

（2）標準曲線的繪製與計算

以標準品百分吸光率為縱坐標，以呋喃唑酮代謝物標準品濃度（µg/L）的半對數為橫坐標，繪製標準曲線圖。將樣本的百分吸光率代入標準曲線中，從標準曲線上讀出樣本所對應的濃度，乘以其對應的稀釋倍數即為樣本中AOZ實際濃度。（具體計算方法需用專用軟體）

普通型

概要和原理

概要和原理同上。

試劑盒特性

試劑盒靈敏度：0.05ppb

檢測下限

組織、蜂蜜檢測下限：0.1ppb

蝦\魚等水產組織因存在一定的干擾，檢測下限在0.2ppb

雞蛋檢測下限：0.1ppb

樣本回收率

水產、肌肉、肝臟組織 ……………………………… 75±15%

蜂蜜樣本 …………………………………………… 90±15%

雞蛋樣本 …………………………………………… 90±20%

交叉反應率

呋喃唑酮代謝物…………………………………… 100%

呋喃它酮代謝物………………………………………＜0.01%

呋喃妥因代謝物 ……………………………………＜0.01%

硝基糠腙（呋喃西林）代謝物…………………………＜0.01%

組成

1、96孔酶標板×1塊 （包被有偶聯抗原）

2、標準液×6瓶：（1ml/瓶）

0ppb,0.05ppb,0.15ppb,0.45ppb,1.35ppb,4.05ppb

3、酶標二抗 12ml ……………………… 紅色帽

4、抗體濃縮液 0.8ml ……………………… 綠色帽

5、底物液 A 液 7ml ……………………… 白色帽

6、底物液 B 液 7ml ……………………… 紅色帽

7、終 止 液 7ml ……………………… 黃色帽

8、20×濃縮洗滌液 40ml ……………………… 透明帽

9、2×濃縮復溶液 50ml ……………………… 透明帽

儀器：

┅┅微孔板酶標儀450nm/630nm

┅┅均質器

┅┅振盪器

┅┅離心機

┅┅微量移液器：單道 20ml～200ml、200ml～1000ml

多道 250ml

┅┅天平：感量0.01g

試劑：

┅┅乙酸乙酯

┅┅正己烷

┅┅K2HPO4?3H2O

┅┅2-硝基苯甲醛

┅┅甲醇

┅┅亞硝基鐵氰化鉀（K2Fe(CN)5?NO?3H2O）（供奶樣用）

┅┅ZnSO4?7 H2O（供奶樣用）

┅┅濃HCl

┅┅NaOH

樣本前處理步驟

註：樣本處理前須知

處理任何樣本時，都必須注意：

（a）實驗中必須使用一次性吸頭，在吸取不同的試劑時

要更換吸頭。

（b）實驗之前須檢查各種實驗器具是否乾淨，必要時可對實驗器具進行清潔，以避免污染干擾實驗結果。

樣本前處理需配製：

配液1：衍生化試劑 15.1mg 2-硝基苯甲醛

加甲醇10ml溶解（濃度為10mM）。

配液2：用去離子水將2×濃縮復溶液與去離子水按1：1體積比進行稀釋（1份濃縮復溶液+1份去離子水）用於抗體稀釋和樣本的復溶。

配液3：C液（供奶樣用）： 12.5g 亞硝基鐵氰化鉀

用去離子水溶解定容至100ml

D液（供奶樣用）：29.8g 硫酸鋅

用去離子水溶解定容至100ml。

配液4：0.1M K2HPO4 22.8g K2HPO4?3H2O

加去離子水溶解定容至1L。

配液5：1M HCl 8.3ml 濃HCl

用去離子水定容至100ml。

配液6：1M NaOH 4g NaOH

用去離子水溶解定容至100ml。

（a）魚蝦和肉樣

┅┅用均質器均質樣本；

┅┅接d的描述方法。

註：樣本應當保存在陰涼避光之處及冷藏保存

（b）奶樣

┅┅取出5ml的樣本到玻璃離心管中；

┅┅分別加入C液和D液各250ml；

┅┅用振盪器充分混合樣本後，用恆溫離心機3000g以上離心10min，4-12 oC（39-54℉）。如果沒有恆溫離心機，則先將樣本降溫至大約8 oC（46℉），然後離心；

┅┅接d的描述方法

（c）蜂蜜

┅┅取1g樣本到離心管中；

┅┅加入4ml的蒸餾水振盪溶解，0.5ml 1M HCL和100ml 衍生化試劑，充分振盪；

┅┅接d第二步描述方法（標 * 處）。

（d）接上面的方法

┅┅取1±0.05g的均質物（魚蝦/肉樣）、牛奶的離心上清液1.1ml（相當於1ml的奶樣），分別加入4ml的蒸餾水， 0.5ml 1M HCL和100ml衍生化試劑，充分振盪；

*┅┅在37 oC過夜孵育（大約16h）；

┅┅分別加入5ml 0.1M K2HPO4，0.4ml 1M NaOH和5ml乙酸乙酯，劇烈振盪30s；

┅┅在室溫下（20-25 oC/68-77℉）3000g以上離心10min；

┅┅取出2.5ml乙酸乙酯到另一個容器中50oC下氮氣吹乾或旋轉蒸發儀蒸乾；

┅┅用1ml正己烷溶解乾燥物，用1ml已稀釋好的復溶液充分混合；

┅┅在室溫下（20-25oC/68-77℉）3000g以上離心10min；

┅┅用50ml下層液體用於分析。

樣本稀釋倍數：2

註：樣本應當保存在陰涼避光處並且需要冷藏保存。

（e）雞蛋

┅┅稱取製備好的雞蛋樣本2g，加入到50ml離心管中，分別加入4ml水，0.5ml 1M HCl，200µlC液，振盪混勻；

┅┅加入200µlD液，充分振盪5min，室溫（20～25℃）3000g以上離心10min；

┅┅取全部上清液，加入200µl衍生化試劑，充分振盪，50℃水浴2h（中間每半個小時劇烈振盪1-2分鐘）；

┅┅分別加入5ml 0.1M K2HPO4,0.4ml 1M NaOH 5ml乙酸乙酯，劇烈振盪30s，室溫（20～25℃）3000g以上離心10min；

┅┅取2.5ml上層有機相於50℃下氮氣吹乾；

┅┅1ml正己烷溶解乾燥物，加入2ml稀釋後的復溶液，振盪10s，3000g以上離心10min（如出現乳化現象，請於60℃水浴中加熱5min，再重複離心）；

┅┅去上層有機相，取下層水相50µl用於分析。

樣本稀釋倍數：2

酶標免疫分析程式：

測定前應須知：

1、使用之前將所有試劑和需用板條的溫度回升至室溫。（20-25℃）。

2、使用之後立即將所有試劑放回2-8℃。

3、在ELISA分析中的再現性，很大程度上取決於洗板的一致性，正確的洗板操作是ELISA測定程式中的要點。

4、在所有恆溫孵育過程中，避免光線照射，用蓋板膜蓋住微孔板。

操作步驟：

1、將試劑盒從冷藏環境中取出並將所需試劑從試劑盒取出，置室溫（20-25℃）平衡30min以上, 注意每種液體試劑使用前均須搖勻。

2、配液：將40ml濃縮洗滌液（20倍濃縮）用去離子水稀釋至800ml備用（或按需量稀釋），稀釋好的洗滌液在4℃環境可保存一個月，使用前也需回溫。

3、取出板架及需要數量的微孔板，將不用的微孔板重新密封，保存於2-8℃不要冷凍。

4、編號：將樣本和標準品對應微孔按序編號，每個樣本和標準品均需做2孔。

5、將濃縮抗體用已稀釋好的復溶液11倍稀釋（1份抗體加入10份稀釋液）。

6、加標準品/樣本50ml/孔，然後加已稀釋好的抗體50ml/孔，用蓋板膜蓋板，25℃環境中反應60min，取出用洗滌液每孔加250ml，洗板5次，每次10秒，拍乾（拍乾後未被清除的氣泡可用乾淨的槍頭刺破）。

7、加酶標二抗：每孔加入100ml，用蓋板膜蓋板後置25℃環境中反應30min。取出用洗滌液每孔加250ml，洗板5次，每次10秒，拍乾（拍乾後未被清除的氣泡可用乾淨的槍頭刺破）。

結果判定

結果判定有兩種方法，粗略判定可用第1種方法，定量判定用第2種方法。注意樣本吸光值與AOZ的含量成負相關。

1、用樣本的平均吸光度值與標準值比較即可得出其濃度範圍(ppb)。假設樣本1的吸光度值為0.310，樣本2的吸光度值為0.820，標準液吸光度值分別是：0ppb為1.510；0.05ppb為1.320；0.15ppb為1.030；0.45ppb為0.660； 1.35ppb為0.389；4.05ppb為0.198。則樣本1的濃度範圍是1.35ppb-4.05ppb，乘以其對應的稀釋倍數； 樣本2的濃度範圍是0.15 ppb-0.45 ppb，乘以其對應的稀釋倍數。

2、定量分析

（1）百分吸光率的計算，標準品或樣本的百分吸光率等於標準品或樣本的百分吸光度值的平均值（雙孔）除以第一個標準（0標準）的吸光度值，再乘以100%，即

百分吸光度值（%）= B ×100%

B0

B—標準溶液或樣本溶液的平均吸光度值

B0—0µg/L標準溶液的平均吸光度值

（2）標準曲線的繪製與計算

以標準品百分吸光率為縱坐標，以呋喃唑酮代謝物標準品濃度（µg/L）的半對數為橫坐標，繪製標準曲線圖。將樣本的百分吸光率代入標準曲線中，從標準曲線上讀出樣本所對應的濃度，乘以其對應的稀釋倍數即為樣本中AOZ實際濃度。