可見光活體成像技術主要採用生物發光（bioluminescence）與螢光（fluorescence）兩種技術。生物發光是用螢光素酶（Luciferase）基因標記細胞或DNA，而螢光技術則採用螢光報告基團（GFP、RFP, Cyt及dyes等）進行標記。利用一套非常靈敏的光學檢測儀器，讓研究人員能夠直接監控活體生物體內的細胞活動和基因行為。通過這個系統，可以觀測活體動物體內腫瘤的生長及轉移、感染性疾病發展過程、特定基因的表達等生物學過程。傳統的動物實驗方法需要在不同的時間點宰殺實驗動物以獲得數據, 得到多個時間點的實驗結果。相比之下，可見光體內成像通過對同一組實驗對象在不同時間點進行記錄，跟蹤同一觀察目標（標記細胞及基因）的移動及變化，所得的數據更加真實可信。另外, 這一技術對腫瘤微小轉移灶的檢測靈敏度極高，不涉及放射性物質和方法, 非常安全。因其操作極其簡單、所得結果直觀、靈敏度高等特點, 在剛剛發展起來的幾年時間內，已廣泛套用於生命科學、醫學研究及藥物開發等方面。
基本介紹
- 中文名：可見光活體成像技術
- 技術組成：生物發光技術、螢光技術
標記原理,光學原理,實驗過程,螢光成像,
標記原理
哺乳動物生物發光，是將Fluc基因整合到細胞染色體DNA上以表達螢光素酶，當外源（腹腔或靜脈注射）給予其底物螢光素（luciferin），即可在幾分鐘內產生髮光現象。這種酶在ATP及氧氣的存在條件下，催化螢光素的氧化反應才可以發光，因此只有在活細胞內才會產生髮光現象，並且光的強度與標記細胞的數目線性相關。對於細菌，lux操縱子由編碼螢光素酶的基因和編碼螢光素酶底物合成酶的基因組成，帶有這種操縱子的細菌會持續發光，不需要外源性底物。
基因、細胞和活體動物都可被螢光素酶基因標記。標記細胞的方法基本上是通過分子生物學克隆技術, 將螢光素酶的基因插到預期觀察的細胞的染色體內，通過單克隆細胞技術的篩選, 培養出能穩定表達螢光素酶的細胞株。目前, 常用的細胞株基本上都已標記好, 市場上已有銷售。 將標記好的細胞注入小鼠體內後, 觀測前需要注射螢光素酶的底物—螢光素，為約280道爾頓的小分子。螢光素脂溶性非常好, 很容易透過血腦屏障。注射一次螢光素能保持小鼠體內螢光素酶標記的細胞發光30-45分鐘。每次螢光素酶催化反應只產生一個光子，這是肉眼無法觀察到的，中科愷盛公司生產的在體生物光學分子成像系統，套用一個高度靈敏的製冷CCD相機及特別設計的成像暗箱和成像軟體，可觀測並記錄到這些光子。
光學原理
光在哺乳動物組織內傳播時會被散射和吸收，光子遇到細胞膜和細胞質時會發生折射現象，而且不同類型的細胞和組織吸收光子的特性並不一樣。在偏紅光區域, 大量的光可以穿過組織和皮膚而被檢測到。在相同的深度情況下, 檢測到的發光強度和細胞的數量具有非常好的線性關係。可見光體內成像技術的基本原理在於光可以穿透實驗動物的組織並且可由儀器量化檢測到的光強度，同時反映出細胞的數量。
實驗過程
通過分子生物學克隆技術, 套用單克隆細胞技術的篩選，將螢光素酶的基因穩定整合到預期觀察的細胞的染色體內，培養出能穩定表達螢光素酶蛋白的細胞株。
典型的成像過程是：小鼠經過麻醉系統被麻醉後放入成像暗箱平台，軟體控制平台的升降到一個合適的視野，自動開啟照明燈拍攝第一次背景圖。下一步，自動關閉照明燈, 在沒有外界光源的條件下拍攝由小鼠體內發出的光，即為生物發光成像。 與第一次的背景圖疊加後可以清楚的顯示動物體內光源的位置，完成成像操作。之後，軟體完成圖像分析過程。使用者可以方便的選取感興趣的區域進行測量和數據處理及保存工作。當選定需要測量的區域後，軟體可以計算出此區域發出的光子數，獲得實驗數據。軟體的數據處理和保存功能非常強大，可以加快實驗速度，方便大批量的實驗。
螢光成像
螢光發光是通過激發光激發螢光基團到達高能量狀態，而後產生髮射光。常用的有綠色螢光蛋白（GFP）、紅色螢光蛋白DsRed 及其它螢光報告基團，標記方法與體外螢光成像相似。螢光成像具有費用低廉和操作簡單等優點。同生物發光在動物體內的穿透性相似，紅光的穿透性在體內比藍綠光的穿透性要好得多，近紅外螢光為觀測生理指標的最佳選擇。
雖然螢光信號遠遠強於生物發光，但非特異性螢光產生的背景噪音使其信噪比遠遠低於生物發光。雖然許多公司採用不同的技術分離背景光，但是受到螢光特性的限制，很難完全消除背景噪音。這些背景噪音造成螢光成像的靈敏度較低。目前大部分高水平的文章還是套用生物發光的方法來研究活體動物體內成像。但是，螢光成像有其方便，便宜，直觀，標記靶點多樣和易於被大多數研究人員接受的優點，在一些植物分子生物學研究和觀察小分子體內代謝方面也得到套用。對於不同的研究，可根據兩者的特點以及實驗要求，選擇合適的方法。最近許多文獻報導的實驗中，利用綠色螢光蛋白和螢光素酶對細胞或動物進行雙重標記，用成熟的螢光成像技術進行體外檢測，進行分子生物學和細胞生物學研究；然後利用生物發光技術進行動物體內檢測，進行活體動物體內研究。
