十二指腸引流液胰蛋白酶

十二指腸引流液胰蛋白酶是胃液和十二指腸引流液檢查的材料。

概述

胰腺實際上是二種具有不同功能的腺體所組成的器官。其中一種是胰的外分泌腺，能分泌胰腺由胰腺導管注入十二指腸。測定體液內胰腺分泌的酶類，對胰腺疾病有一定的輔助診斷價值。

十二指腸引流液胰蛋白酶的醫學檢查

檢查名稱

十二指腸引流液胰蛋白酶

分類

體液和排泄物檢查 > 胃液和十二指腸引流液檢查

取材

十二指腸引流液

十二指腸引流液胰蛋白酶的測定原理

本法是標記抗原（Ag·）和非標記抗原（Ag）對特異性抗體（Ab）的競爭抑制反應，其反應為Ag·+Ag+Ab（Ag·Ab）+（AgAb）。當Ag·和Ab的量保持恆定，Ag與Ag·之和大於Ab上的有效結合點的數目，在該條件下，Ag與Ag·間存在著函式關係，亦即隨著Ag濃度增加，Ag-Ab生成量多，而Ag·-Ab的數量則減少，游離的Ag·就增多。因為Ag·對Ab的結合，可因Ag競爭結合而遭抑制。反之，當Ag量少時，Ag-Ab生成量就少，Ag·-Ab量增多，而游離的Ag·減少。將結合的抗原抗體複合物（B）與游離抗原（F）分離，分別測定B和F的放射活性，計算出B/F或B/B+F值，可制出B/F或B/B+p對Ag量的關係曲線圖。測定時，需用一系列已知濃度的Ag和一定量Ag·及相應抗體Ab混合，然後測出各標準濃度Ag參加下的Ag·-Ab放射結合率（B/B+F）或（B/F），繪出競爭抑制標準曲線。試驗時，在同樣條件下，根據被測Ag的放射性結合率，從標準曲線上查知相應Ag含量。

試劑

（1）抗原的純化：試驗需用高純度的抗原。通常，蛋白質抗原的純度應達到電泳分析純，電泳後僅顯示單一區帶，並具有足夠或完整的免疫原性。一般先經聚丙烯醯胺電泳鑑定，再用等電聚焦SDS聚丙烯醯胺雙相電泳鑑定為單一區帶，然後用於免疫動物和核素標記。

純抗原因其溶液中缺乏其他蛋白質作穩定劑，或因貯存在純離子濃度的緩衝液中，故易形成聚合物，因此在純化抗原時需加注意。若採用聚合物抗原的標記，用於RIA中將會顯著增加非特異性結合，降低測定的靈敏度。

（2）抗原的標記方法：標記用的核素有γ射線和β射線兩大類。前者常用131I、125I、51Cr,後者多用3H、32P和14C。選擇放射性核素首先要考慮比放射性，比放射性愈高，參與反應的抗原化學量就愈小，測定方法的靈敏度相對就愈高。核放射性和半衰期要適宜，便於使用和防護。標記後的抗原要保持其免疫原性。標記技術要簡便、經濟。

標記方法有直接標記和間接標記兩大類，以最常用的125I為例分述如下。

①直接標記：將125I直接結合於蛋白質側鏈殘基的酪氨酸上，步驟單一，操作簡便，標記物的比放射性較高，但此法僅能用於標記含酪氨酸的化合物，如所含的酪氨酸殘基為蛋白質的特異性和生物活性所必需，則該活性易因標記而失活。

最常用的直接標記法為氯胺T標記法（簡稱h-T）：氯胺T是對甲基苯磺基醯胺的N氯衍生物的鈉鹽，在水溶液中分解形成次氯酸成為一種氧化劑。在偏鹼溶液中（pH值7.5）能使帶負電荷的125I離子（Na-125I）氧化成帶正電荷的125I離子，藉以取代蛋白質酪氨酸苯環的氫，形成二碘酪氨酸。

125I標記率的高低與抗原（蛋白質或多肽）分子中酪氨酸的含量及其在分子中的暴露程度有關。

標記方法的原則是將純化抗原和125I加入小試管底部，繼將配製的氯胺T快速沖入，混勻振盪1～2min後加入偏重亞硫酸鈉終止反應。再加碘化鉀溶液稀釋，然後在葡聚糖G50柱上分離，分別用井型閃爍計數器測定放射性強度（脈衝數/min、cpm），前部為標記抗原峰，後部為游離125I峰。在標記抗原峰試管中加等量1%白蛋白作為穩定劑即為標記抗原液。

②間接標記：是先將125I標記在載體上，純化後再與蛋白質或肽抗原結合，用N琥珀醯亞胺-3-[4-羥5-（125I）碘苯]丙酸鹽（NSHPP）作為間接標記試劑，該試劑的N琥珀醯亞胺基與多肽游離氨基縮合為結合物，使125I標記的苯基與蛋白質的氨基結合。

本法先以氯胺T使125I接上NSHPP，由於在水溶液中它迅速水解為3-（4-羥苯基）丙酸，故在碘化反應中要儘快減少這種水解作用。這種碘標記物必須從水箱抽提到有機溶液中去，再除去有機溶劑後，使125I-NSHPP與蛋白質結合，製成125I-NSHPP-蛋白質標記物。

本法可標記缺乏酪氨酸殘基的多肽，其最大優點是不損傷蛋白質的活性，能保存標記物高度的酶活性或免疫活性，適合於對不穩定的蛋白質標記，缺點是操作複雜，標記率低。

（3）標記抗原的鑑定：為保證放射免疫測定的質量，製備的標記物必需作如下鑑定：

游離放射性碘的含量 用三氯乙酸將所有蛋白質沉澱，分別測定沉澱物和上清液的cpm值。一般要求游離碘占總放射性碘的5%以下。標記抗原貯存過久時，可出現標記物的解離，一旦超過5%則應廢棄。

免疫活性 用小量標記抗原加過量抗體，反應後分離B和F，分別測定其放射性，算出百分結合率，此值應在80%以上，值越大，表示損傷抗原越少。

放射強度 它是指單位重量抗原的放射強度，比放射性越高，測定越敏感。標記抗原的比放射性以125I的標記率或利用率表示。

（4）抗體的製備和鑑定 RIA中所用的抗體應具有高親和力和高特異性，製備高價單相抗血清，最好以標記用的純化抗原免疫動物，製備半抗原的抗血清，需先將半抗原與載體結合，使成免疫原，常用的載體為牛血清白蛋白。

抗血清同樣也要加以嚴格鑑定，包括其靈敏度、親和力和特異性。在固定量標記抗原與不同濃度的抗血清作用的條件下，測定B/F值，製得一條B/F值對不同稀釋度抗血清的曲線圖，該曲線的直線部分上段的斜率是抗體最大親和力的定性標誌，也是靈敏度的標誌。斜率越大，RIA靈敏度越高，在許多RIA反應系統中，呈最大靈敏度的抗體濃度為B/F=1。

當採用固定量的抗體（Q0）與不同濃度的抗原作用時，以B/F對B作圖，所得曲線的斜率就是親和常數（Ka）的負數。

在RIA反應系統中，測定結構相似的不同物質時，可以鑑定抗體的特異性。

操作方法

本法分三個步驟，即抗原與抗體反應、B和F分離和放射性測定。

（1）抗原與抗體反應：將標本（非標記抗原）、標記抗原和抗血清順序定量加入小試管內，置室溫（15～30℃）作用24h，使其充分競爭結合。

（2）B、F分離：分離技術多種多樣，常用沉澱法。①第二抗體沉澱法：又稱雙抗體法，在受檢抗原與第一抗體特異性反應後加入相應的第二抗體，使形成的抗原-第一抗體-第二抗體的複合物共沉，一經離心即可使結合標記抗原B與游離抗原F分離。本法是特異性沉澱，分離完全，非特異性結合力低。但第二抗體用量較大，成本較高。此外標本濃度、抗凝劑的有無因素可在一定程度上影響結果。②聚乙二醇（PEG）沉澱法：使蛋白質處於等電點狀態，水化層破壞而導致蛋白質沉澱。本法優點是PEG製備方便、價廉、分離快速，缺點是非特異沉澱物較多，分離不完全。③第二抗體-聚乙二醇沉澱法：本法既有PEG法的快速沉澱優點，且保持第二抗體特異性沉澱的作用，又減少第二抗體用量，並降低PEG濃度，使非特異沉澱物減少。④活性炭吸附法：利用活性炭表面活性將小分子的游離部分吸附。如在活性炭表面塗上一層葡聚糖，使它表面具有一定孔徑的網眼，從而允許小分子游離抗原或半抗原逸入而被吸附，而大分子複合物則被排斥在外。在抗原與抗體反應後，加入葡聚糖-活性炭，放置5～10min，使游離抗原吸附在活性炭顆粒上，離心使顆粒沉澱，上清液中含有結合的標記抗原。

（3）放射性強度測定：B和F分離後，即可測定其放射性強度。測量儀器有兩類：液體閃爍計數儀（測β射線）和晶體閃爍計數儀（測γ射線）。計數單位是探測器輸出的電脈衝數，單位為cpm（脈衝數/min）。

每次測定均需作一標準曲線圖，以標準抗原的不同濃度為橫坐標，以測到的相應放射性強度為縱坐標作圖。放射性強度可任選B或F，亦可採用計算值B/B+F、B/F或B/B0。標本應作雙份測定，取其平均值，在標準曲線上查出相應的受檢抗原濃度。

正常值

0.35～1.60 （35%～160%）。

化驗結果臨床意義

降低：胰腺分泌功能不全、胰膽管阻塞。

附註

口服酶製劑，可引起酶活性升高。