動物鬚毛癬菌角蛋白酶基因的敲除與致病功能分析

《動物鬚毛癬菌角蛋白酶基因的敲除與致病功能分析》是依託中國農業大學，由金藝鵬擔任項目負責人的青年科學基金項目。

基本介紹

• 中文名：動物鬚毛癬菌角蛋白酶基因的敲除與致病功能分析
• 依託單位：中國農業大學
• 項目負責人：金藝鵬
• 項目類別：青年科學基金項目

項目摘要

皮毛動物養殖是我國畜牧業重要組成部分，鬚毛癬菌作為主要的皮毛動物癬病致病真菌，會造成裘皮生產業的巨大損失，深入揭示該病原的致病機理對動物健康與行業發展具有重要意義。角蛋白酶是毛癬菌主要致病因子，是真菌破壞機體防禦屏障的關鍵因素，決定著病原致病性的強弱，但目前仍不清楚的是：毛癬菌角蛋白酶的決定基因的確切定位，其改變將如何影響角蛋白酶活性與病原的致病性？為了確定鬚毛癬菌角蛋白酶基因，探討角蛋白酶基因參與致病的機制，申請人將通過ATMT系統遺傳轉化鬚毛癬菌，把抗性T-DNA同源重組插入菌體基因組，引發菌株定點突變，實現對角蛋白酶基因的定位與敲除。對基因敲除株進行基因、表型、致病特徵與角蛋白酶活性的分析比對，尋找其中的變化規律。從而在鬚毛癬菌基因組中鎖定角蛋白酶基因位置，明確這些基因對角蛋白酶活性的調控功能與對病原致病性的影響規律，為進一步揭示真菌致病機理、研製高效真菌疫苗、服務臨床奠定基礎。

結題摘要

須癬毛癬菌（Trichophyton mentagrophytes）是常見的人畜共患皮膚真菌病病原，能引起嚴重的皮膚感染。金屬蛋白酶（MEP）作為角蛋白酶的主要組成部分，被認為是須癬毛癬菌入侵機體過程中的重要毒力因子和營養因子，相應基因的缺失可能對須癬毛癬菌的毒力產生一定影響。本研究中根據須癬毛癬菌5個MEP基因片段設計引物高保真擴增，引入潮黴素抗性基因（hph）片段構建5個基因敲除用雙元載體。通過根癌農桿菌介導的轉化體系（ATMT）分別對須癬毛癬菌5個MEP基因進行定位與敲除。得到穩定的基因敲除株後，首先使用人粗製角蛋白作為誘導，對比須癬毛癬菌MEPs基因轉化株和標準株對於角蛋白的消化能力；隨後使用上述各菌株對人發和犬毛、狐狸毛、貓毛、豚鼠毛等5種毛髮進行穿孔試驗；最後使用上述菌株接種豚鼠皮膚，通過砂紙法建立須癬毛癬菌感染模型。上述三項毒力試驗的結果提示，須癬毛癬菌MEPs基因缺失會對其蛋白消化能力和致病性造成影響。在須癬毛癬菌分泌金屬蛋白酶參與致病的過程中，MEP4與MEP5基因可能起到了關鍵作用，而MEP3基因的功能相對較弱。本研究有助於闡明須癬毛癬菌的致病機制及金屬蛋白酶在致病過程中發揮的作用。