《利用CRISPR/Cas9新技術篩選和鑑定端粒相關的長非編碼RNA》是依託中山大學，由松陽洲擔任項目負責人的重大研究計畫。
基本介紹
- 中文名：利用CRISPR/Cas9新技術篩選和鑑定端粒相關的長非編碼RNA
- 項目類別：重大研究計畫
- 項目負責人：松陽洲
- 依託單位：中山大學
中文摘要,結題摘要,
中文摘要
生命活動過程通過非常複雜的核酸和蛋白網路相互調控實現。我們前期在端粒領域的系統性工作揭示了非編碼RNA在調節端粒長度與細胞衰老方面發揮重要功能。基因組中含有大量非編碼RNA信息，其中長非編碼RNA（lncRNAs）約有11萬個，但人們對於這些lncRNAs的生物學功能還知之甚少。lncRNAs通常依賴本身形成特定的高級結構發揮功能，常規單gRNA介導的CRISPR/Cas9切割難以造成lncRNAs的功能缺失，因此目前還沒有系統性篩選研究lncRNAs的成熟工具。本項目擬利用自主構建的CRISPR/Cas9-lncRNA雙guide RNA打靶文庫，以多能性幹細胞為研究對象，篩選和檢測端粒相關蛋白複合物中特異結合的lncRNAs；構建並分析特定lncRNAs的敲除小鼠模型，最終闡明幹細胞中端粒相關lncRNAs的調控機制與功能網路，及其對幹細胞維持多能性和自我更新能力的作用。
結題摘要
生命活動過程通過非常複雜的核酸和蛋白網路相互調控實現。我們前期在端粒領域的系統性工作揭示了非編碼RNA在調節端粒長度與細胞衰老方面發揮重要功能。基因組中含有大量非編碼RNA信息，其中長非編碼RNA（lncRNAs）約有11萬個，但人們對於這些lncRNAs的生物學功能還知之甚少。本項目擬利用自主構建的CRISPR/Cas9-lncRNA雙guide RNA打靶文庫，以多能性幹細胞為研究對象，篩選和檢測端粒相關蛋白複合物中特異結合的lncRNAs，在以下三方面取得了進展：（1）雙gRNA系統的建立與新型基因編輯工具的開發；（2）非編碼RNA與幹細胞研究；（3）端粒相關蛋白的篩選和功能研究。具體的，我們開發針對成對gRNA設計的生物信息學預測軟體pgRNAFinder，並針對端粒蛋白大片段缺失敲除的成對gRNAs。通過與單條gRNA敲除效果的比較，我們發現雙gRNA敲除體系具有更強的工作效力。通過篩選，我們發現Nanog互作lncRNA linc1343在幹細胞乾性維持及分化方面起到關鍵作用。為了便於示蹤長非編碼RNA，成功開發了一種新的實時追蹤lncRNAs和進行RIP實驗的lncRNAs標記系統，對於深入研究長非編碼RNA提供了新工具。我們還致力於新型基因編輯工具的開發，利用二代高保真的二代鹼基編輯系統（HF2-BE2）在小鼠受精卵中進行基因編輯，並開發了EndoV-seq技術以探究並提高ABE的特異性。我們系統篩選和鑑定了新的端粒相關蛋白，如SBDS和TOE1等，做了一系列深入研究，同時建立了端粒和衰老相關生物信息學分析以及基因編輯的關鍵平台，在端粒和衰老領域取得了一系列進展。在項目的支持下，共發表論文13篇，申請1項專利。項目成果超出預期目標。
