利用微生物拮抗作用清除滴灌系統灌水器堵塞的方法

《利用微生物拮抗作用清除滴灌系統灌水器堵塞的方法》是中國農業大學於2014年1月16日申請的專利，該專利的申請號為2014100193409，公布號為CN103752560A，授權公布日為2014年4月30日，發明人是李雲開、王克遠、王天志、張志靜。

《利用微生物拮抗作用清除滴灌系統灌水器堵塞的方法》公開了利用微生物拮抗作用清除滴灌系統灌水器堵塞的方法。該發明提供了一種清除滴灌系統灌水器堵塞的方法，包括如下步驟：1）將用於灌溉的水源進行膜過濾，收集固體顆粒物，分離純化所述固體顆粒物中的微生物，選取豐度最高的菌種，為誘發堵塞關鍵菌；2）將所述誘發堵塞關鍵菌與農用微生物菌進行拮抗反應，選擇與所述誘發堵塞關鍵菌有拮抗作用的農用微生物菌作為拮抗菌；所述農用微生物菌為枯草芽孢桿菌、防病促生芽孢桿菌或內生芽孢桿菌；3）將所述拮抗菌加入灌溉水中，施加到堵塞處進行反應，再沖洗反應後滴灌管，實現清除滴灌系統灌水器堵塞。該發明優點：加拮抗菌劑後，對系統進行沖洗，可有效將脫落的堵塞物質排出系統外。

2018年12月20日，《利用微生物拮抗作用清除滴灌系統灌水器堵塞的方法》獲得第二十屆中國專利優秀獎。

基本介紹

• 中文名：利用微生物拮抗作用清除滴灌系統灌水器堵塞的方法
• 公告號：CN103752560A
• 授權日：2014年4月30日
• 申請號：2014100193409
• 申請日：2014年1月16日
• 申請人：中國農業大學
• 地址：北京市海淀區圓明園西路2號
• 發明人：李雲開、王克遠、王天志、張志靜
• Int.Cl.：B08B7/00(2006.01)I
• 代理機構：北京紀凱智慧財產權代理有限公司
• 代理人：關暢
• 類別：發明專利

專利背景

灌水器是滴灌系統最關鍵的部件，其作用是使有壓水流通過其內部的狹長流道或微孔充分消能後，以均勻、穩定的小流量滴入土壤。但也正是由於灌水器消能的需要，流道尺寸一般只有0.5～1.2毫米左右，水中的懸浮物、溶解鹽、化學沉澱、溶解性有機物、微生物等雜質都極易引起灌水器的堵塞，灌水器堵塞問題已成為制約滴灌技術套用、推廣的主要障礙，它解決的好壞直接決定著滴灌工程的使用壽命和套用效益。目前，大量的科研學者研究通過合理配置過濾設備、以及灌水器流道最佳化設計等多方面來解決系統堵塞問題，取得了一些較有意義的成果，但堵塞問題依然未能得到很好地解決，主要原因在於對灌水器堵塞的機理還缺乏深入、系統的認識。

最新（截至2014年1月16日）研究報導顯示：滴灌系統的堵塞與灌溉系統內生物膜的形成、生長有著密切的關係，其過程為灌溉水源中微生物首先在滴灌系統毛管內部固定形成生物膜，並不斷攝取、消耗水中的底物和營養物進行新陳代謝，分泌大量的胞外多聚物，並依靠胞外多聚物的粘性不斷吸附微生物及固體懸浮顆粒物，引起生物膜不斷形成、生長與脫落以及堵塞沉積物的不斷聚集，最終導致灌水器堵塞，生物膜是灌水器堵塞產生的初始條件及誘發因素。因此，採取有效措施抑制生物膜生長，促進生物膜脫落並及時將生物膜排出系統成為解決灌水器堵塞問題的關鍵。所以研究通過抑制滴灌系統內生物膜形成的生物堵塞具有重要意義。國內外廣大研究人員對解決滴灌系統灌水器堵塞問題給予了廣泛關注，相關專家學者也提出了防治滴灌灌水器堵塞的相關專利：中國農業科學院農田灌溉研究所高勝國等（授權公告號：CN202168387）公開了滴灌系統抗生物堵塞裝置，藉助臭氧發生器，有效殺死流道內微生物。但其結構相對複雜，成本較高，長時間使用會對土壤群落結構甚至土壤健康質量產生一定的影響，不適宜在大田普遍推廣套用。

發明內容

專利目的

《利用微生物拮抗作用清除滴灌系統灌水器堵塞的方法》的目的是提供一種清除滴灌系統灌水器堵塞的方法。

技術方案

《利用微生物拮抗作用清除滴灌系統灌水器堵塞的方法》提供的方法，包括如下步驟：

1）將引起堵塞的且用於灌溉的水源進行菌種分析，選取豐度最高的菌種，為誘發堵塞關鍵菌；

2）選擇與所述誘發堵塞關鍵菌有拮抗作用的農用微生物菌作為拮抗菌；所述農用微生物菌為對農田作物無害的農用微生物菌；

3）將所述拮抗菌加入灌溉水中，施加到堵塞處進行反應，再沖洗反應後灌水器，實現清除滴灌系統灌水器堵塞。

上述方法中，步驟3）中，所述拮抗菌按照終濃度為10-10每毫升菌落數加入灌溉水；

所述施加的方式為兩天一次、所述施加次數為兩次，所述每次施加時間為10-15分鐘；每施加一次後沖洗一次；

所述反應時間為24小時；

所述沖洗的流速為0.45±0.05米/秒，所述沖洗的時間為5-10分鐘；

所述拮抗菌以菌株或者菌劑形式加入灌溉水。

上述方法中，步驟1）中，所述菌種分析為將所述引起堵塞的且用於灌溉的水源進行膜過濾，收集固體顆粒物，分離純化所述固體顆粒物中的微生物，選取豐度最高的菌種，為誘發堵塞關鍵菌；

步驟2）中，選擇與所述誘發堵塞關鍵菌有拮抗作用的農用微生物菌作為拮抗菌的方法包括如下步驟：將所述誘發堵塞關鍵菌與所述農用微生物菌進行拮抗反應，選擇與所述誘發堵塞關鍵菌有拮抗作用的農用微生物菌作為拮抗菌。

上述方法中，步驟1）中，所述膜過濾採用膜孔徑為0.1-0.2微米的微濾膜；

所述分離純化採用的培養基為LB培養基，培養溫度為37度；

步驟2）中，所述拮抗反應包括如下步驟：將所述誘發堵塞關鍵菌與所述農用微生物菌進行平板拮抗，選取與所述誘發堵塞關鍵菌具有拮抗作用的農用微生物菌A。

上述方法中，步驟2）中，在所述平板拮抗後還包括如下步驟：將所述農用微生物菌A與所述誘發堵塞關鍵菌用Biolog生態板進行拮抗反應，選取與所述誘發堵塞關鍵菌具有拮抗作用的農用微生物菌A作為拮抗菌。

上述方法中，所述引起堵塞的且用於灌溉的水源為CASS工藝處理後的生活污水，在《利用微生物拮抗作用清除滴灌系統灌水器堵塞的方法》的實施例中，用於灌溉的水源為北京市昌平區北七家污水處理廠的生活污水經過CASS工藝處理得到的再生水。

所述誘發堵塞關鍵菌為Arcicella.sp；

所述拮抗菌為內生芽孢桿菌或內生芽孢桿菌菌劑或抗重茬菌劑；

內生芽孢桿菌或內生芽孢桿菌菌劑或抗重茬菌劑在清除滴灌系統灌水器堵塞中的套用也是《利用微生物拮抗作用清除滴灌系統灌水器堵塞的方法》保護的範圍。

內生芽孢桿菌菌劑（也稱為綠康微經濟類作物菌劑），購自中農綠康（北京）生物技術有限公司；

抗重茬菌劑（廣譜），購自中農綠康（北京）生物技術有限公司。

改善效果

《利用微生物拮抗作用清除滴灌系統灌水器堵塞的方法》的實驗證明，《利用微生物拮抗作用清除滴灌系統灌水器堵塞的方法》具有如下優點：（1）高效性：《利用微生物拮抗作用清除滴灌系統灌水器堵塞的方法》直接鎖定誘發灌水器堵塞的微生物，提出了以控制生物膜形成、生長為目標的滴灌灌水器堵塞的生物加拮抗菌劑並配合管道沖洗清除方法。通過在滴灌系統中通入含有拮抗菌劑的水，可有效抑制堵塞物質的生長，促進其脫落。加拮抗菌劑後，對系統進行沖洗，可有效將脫落的堵塞物質排出系統外，大大減小灌水器堵塞風險。

（2）經濟性：發現的兩種菌劑價格低廉，通過採用這種方法清除灌水器堵塞，可以有效延長滴灌帶使用期1-2年，降低了滴灌系統的總體投資。

（3）環保性：套用此發明清除灌水器堵塞，不會對植物、土壤及地下水環境有任何危害，而且這兩種菌劑還可以控制植物的某些疾病，有一舉兩得的效果，是一種解決灌水器堵塞問題的環境友好型方法。

（4）可操作性：通過滴灌系統首部的施肥罐可將拮抗菌劑施加到灌溉水中，進而達到解決灌水器堵塞的目標，不需要任何其他附加裝置，操作簡便。

附圖說明

圖1為《利用微生物拮抗作用清除滴灌系統灌水器堵塞的方法》工作流程圖。

圖2為菌劑拮抗試驗部分灌水器流量變化圖。

技術領域

《利用微生物拮抗作用清除滴灌系統灌水器堵塞的方法》涉及生物技術領域，尤其涉及一種利用微生物拮抗作用清除滴灌系統灌水器堵塞的方法。

權利要求

1.一種清除滴灌系統灌水器堵塞的方法，其特徵在於：所述方法包括如下步驟：

1）將引起堵塞的且用於灌溉的水源進行菌種分析，選取豐度最高的菌種，為誘發堵塞關鍵菌；

2）選擇與所述誘發堵塞關鍵菌有拮抗作用的農用微生物菌作為拮抗菌；所述農用微生物菌為對農田作物無害的農用微生物菌；

3）將所述拮抗菌加入灌溉水中，施加到堵塞處進行反應，再沖洗反應後灌水器，實現清除滴灌系統灌水器堵塞；

步驟1）中，所述菌種分析為將所述引起堵塞的且用於灌溉的水源進行膜過濾，收集固體顆粒物，分離純化所述固體顆粒物中的微生物，選取豐度最高的菌種，為誘發堵塞關鍵菌；

步驟2）中，選擇與所述誘發堵塞關鍵菌有拮抗作用的農用微生物菌作為拮抗菌的方法包括如下步驟：將所述誘發堵塞關鍵菌與所述農用微生物菌進行拮抗反應，選擇與所述誘發堵塞關鍵菌有拮抗作用的農用微生物菌作為拮抗菌；

步驟3）中，所述拮抗菌按照終濃度為10-10每毫升菌落數加入灌溉水；施加的方式為兩天一次、施加次數為兩次，每次施加時間為10-15分鐘；每施加一次後沖洗一次；反應時間為24小時；沖洗的流速為0.45±0.05米/秒，沖洗的時間為5-10分鐘；所述拮抗菌以菌株或者菌劑形式加入灌溉水；所述引起堵塞的且用於灌溉的水源為CASS工藝處理後的生活污水；所述誘發堵塞關鍵菌為Arcicella.sp。

2.根據權利要求1所述的方法，其特徵在於：

步驟1）中，所述膜過濾採用膜孔徑為0.1-0.2微米的微濾膜；所述分離純化採用的培養基為LB培養基，培養溫度為37度；

步驟2）中，所述拮抗反應包括如下步驟：將所述誘發堵塞關鍵菌與所述農用微生物菌進行平板拮抗，選取與所述誘發堵塞關鍵菌具有拮抗作用的農用微生物菌。

3.根據權利要求1或2所述的方法，其特徵在於：所述拮抗菌為內生芽孢桿菌或抗重茬菌。

實施方式

操作內容

《利用微生物拮抗作用清除滴灌系統灌水器堵塞的方法》的思路：《利用微生物拮抗作用清除滴灌系統灌水器堵塞的方法》利用微生物拮抗原理，尋求誘發灌水器堵塞的關鍵菌群的拮抗微生物來抑制微生物活性、粘性分泌物以及生物膜的生長，進而降低生物膜與灌水器壁面粘附力，進而增強生物膜的可脫落性，從而達到清除灌水器堵塞的目的。在生物膜微生物群落生物化學組分分析尤其是細菌種類的初步研究基礎上，培養、分離、篩選出誘發堵塞關鍵菌；選用拮抗性較好的微生物菌劑。進行誘發堵塞關鍵菌和微生物菌劑中優勢菌之間的拮抗試驗，並對篩選出的拮抗菌劑進行驗證試驗，以此確定適合抑制誘發堵塞關鍵菌生長的菌劑。將成功篩選的菌劑，以不同的施用模式（不同的施用濃度、時間、頻率）進行滴灌試驗，最終確定相對高效的施用模式。

唯一碳源利用方法由美國BIOLOG公司於1989年開發成功，最初套用於純種微生物鑑定。其載體是BIOLOG公司生產的微孔板，微孔板為96孔，其中95個孔中加入了95種單一的不同碳源和四唑染料，另外一個孔未加碳源作為對照。根據不同的用途，BIOLOG公司生產了加入不同碳源的多種微孔板，這其中用於群落多樣性分析最多的是革蘭氏陰性板（GN）和生態板（Eco）。其中Eco板是專門為群落分析而設計，每個板上只有31種碳源，設定了3個重複。分析時將處理過的微生物菌液接種到微孔板的孔中後，孔中的生物就可能利用其中的碳源發生氧化還原作用，而孔中一旦有電子轉移，四唑染料就會變為紫色，再根據顏色反應的深淺讀出每孔的OD值，以獲得不同孔中碳源被接種到其中的微生物所利用的程度。最後運用多變數統計分析方法來分析微生物群落產生的代謝多樣性類型及其變化。

實施案例

下述實施例中如無特殊說明，所用液體培養基均為LB液體培養基，所用的固體培養基均為LB固體培養基。

• 實施例1 清除滴灌系統灌水器堵塞的方法

圖1為《利用微生物拮抗作用清除滴灌系統灌水器堵塞的方法》工作流程圖。

一、誘發堵塞關鍵菌提取

1、固體顆粒物提取

將用於灌溉的水源（北京市昌平區北七家污水處理廠的生活污水經過CASS工藝處理得到的再生水）微濾膜（膜孔徑為0.2微米）進行過濾，收集固體顆粒物；

2、分離純化固體顆粒物中的微生物

對上述1得到的固體顆粒物進行分離純化，採用純培養的方法，具體如下：

將收集的固體顆粒物加入到100毫升已經高壓高溫滅菌的LB液體培養液中，在常溫（25度）搖床上24小時培養（轉速為60轉/分），得到固體顆粒物中的微生物菌群；

將微生物菌群先用水稀釋1000倍，均勻塗布在固體LB平板上，在37度恆溫微生物培養箱中培養24小時；再挑取單菌落在新的LB平板不斷劃線37度培養，共獲得100個純培養菌。

將純培養菌均提取基因組DNA，採用Roche454GSJunior測序儀（羅氏公司）和配套的GSFLX反應體系試劑盒對DNA片段進行細菌16SrRNA的高通量測序（通用引物：338F：ACTCCTACGGGAGGCAGCAG；907R：CCGTCAATTCMTTTGAGTTT；M為簡併序列）。

測序結果在MG-RAST序列比對資料庫網站（實際套用中，也可使用MEGAN、RDP

classifier、NIHBlast等本地軟體）進行菌群資料庫比對和物種注釋，獲得樣本的菌群結構，即各門/屬/種的細菌分別測出哪些，各自的測序讀取次數（reads數目）以及各自的讀序次數占樣本測序讀取總次數的百分比（相對豐度）。

結果從純培養菌中選取相對豐度最高的菌種（15%）為誘發堵塞關鍵菌，為Arcicella.sp。

二、拮抗菌劑的選擇

《利用微生物拮抗作用清除滴灌系統灌水器堵塞的方法》選用三種無公害的農用微生物菌劑與誘發堵塞關鍵菌進行拮抗試驗：

枯草芽孢桿菌菌劑（也稱為多肽植物素肥料），購自北京世紀阿姆斯生物技術股份有限公司，產品編號：AMMS0602，有效菌種枯草芽孢桿菌；

內生芽孢桿菌菌劑（也稱為綠康微經濟類作物菌劑），購自中農綠康（北京）生物技術有限公司；

抗重茬菌劑（廣譜），購自中農綠康（北京）生物技術有限公司。

1、平板拮抗試驗

1）、候選拮抗菌劑培養

分別將適量枯草芽孢桿菌菌劑、抗重茬菌劑、內生芽孢桿菌菌劑接種到100毫升滅菌的LB液體培養基中，放入37度恆溫搖床上24小時培養，得到枯草芽孢桿菌菌液、抗重茬菌菌液、內生芽孢桿菌菌液。

2）、平板拮抗

將農用微生物菌的枯草芽孢桿菌菌液、抗重茬菌菌液、內生芽孢桿菌菌液分別與上述一得到的誘發堵塞關鍵菌進行平板拮抗篩選，即在平板中間塗誘發堵塞關鍵菌，以中間誘發堵塞關鍵菌株為圓心，在平板邊緣塗農用微生物菌。觀察二者的生長情況確定菌株是否具有拮抗性。

經過篩選，確定對誘發堵塞關鍵菌具有拮抗作用的農用微生物菌有：內生芽孢桿菌劑。

2、利用Biolog生態板驗證農用微生物菌的拮抗性

下述實驗的農用微生物菌採用上述1中確定的與誘發堵塞關鍵菌相互拮抗的農用微生物菌：內生芽孢桿菌。

①分別在LB培養基中培養誘發堵塞關鍵菌、抗重茬菌劑和內生芽孢桿菌菌劑，同時間放入37度恆溫搖床上24小時培養，得到誘發堵塞關鍵菌菌液、抗重茬菌菌液、內生芽孢桿菌菌液。

②分別取5毫升誘發堵塞關鍵菌菌液、抗重茬菌菌液、內生芽孢桿菌菌液離心（轉速16000/分鐘；10分鐘）取上清液，稀釋1000倍，加入到BIOLOG-Eco板中；

再將誘發堵塞關鍵菌菌液、抗重茬菌菌液、內生芽孢桿菌菌液等體積混合，稀釋1000倍，注入到BIOLOG-Eco板中。

③生態板每隔12小時測試一次，利用自動測試儀器測試碳源利用情況。用AWCD（averagewellcolordevelopment）值來反映微生物群落對微孔板上碳源的利用情況，計算公式如下：

AWCD=∑（C-R）/n

其中C為每一個孔里的顏色變化（光密度），R為微孔板上空白孔的光密度，n為碳源的數量。

④分析AWCD（averagewellcolordevelopment）值，確定菌拮抗性。

通過分析發現內生芽孢桿菌、抗重茬菌菌液、誘發堵塞關鍵菌混合使用對碳源的利用程度都要小於單獨使用菌時對碳源的利用，可以得出，抗重茬菌劑、內生芽孢桿菌劑對誘發堵塞關鍵菌的生長有抑制作用。

綜合以上兩種篩選辦法，選取抗重茬菌劑、內生芽孢桿菌劑均可作為拮抗性菌，用以清除再生水滴灌系統灌水器生物堵塞。

三、施加拮抗菌劑配合管道沖洗清除灌水器堵塞

1、清除堵塞

1）施加菌劑

將適量內生芽孢桿菌菌劑（也稱為綠康微經濟類作物菌劑，購自中農綠康（北京）生物技術有限公司）接種到液體LB培養基中，37度培養24小時，得到內生芽孢桿菌菌液；將內生芽孢桿菌菌液以終濃度為109每毫升菌落數加入灌溉水中，通過施肥罐施加到堵塞處進行反應。

內生芽孢桿菌菌劑施加模式為每兩天一次，連續施加兩次，每次施加時間為15分鐘。

2）沖洗管道

在每次施加內生芽孢桿菌後，待拮抗菌劑反應24小時後，對滴灌管用水沖洗，沖洗流速為0.45米/秒，沖洗時間為10分鐘。

施加拮抗菌劑後，脫落的堵塞物質會增加灌水器堵塞風險，需及時排出系統，即需對系統進行沖洗。

2、檢測

清除堵塞後通水，在不同的通水時間持續觀測該灌水器的流量動態變化過程，從而判斷堵塞清除效果。

通過稱重法每天測量灌水器的出水重量進而得出其流量：流量=出水重量/（出水時間×水密度）。

相對額定流量=（堵塞灌水器的流量/未堵塞灌水器的流量）×100%

堵塞清除效果如圖2所示，a、b、c、d分別代表四個堵塞灌水器，可以看出，絕大多數已堵塞灌水器的流量恢復至最初額定流量，其餘灌水器堵塞程度也有較大改善，可恢復至額定流量的70%以上。

抗重茬菌劑按照上述方法試驗，結果無顯著差異，也可以達到疏通灌水器的作用。

榮譽表彰

2018年12月20日，《利用微生物拮抗作用清除滴灌系統灌水器堵塞的方法》獲得第二十屆中國專利優秀獎。