《利用小分子RNA製備個體化誘導性多能幹細胞(IPSCs)的研究》是依託中山大學，由麥慶雲擔任項目負責人的面上項目。
基本介紹
- 中文名：利用小分子RNA製備個體化誘導性多能幹細胞(IPSCs)的研究
- 項目類別：面上項目
- 項目負責人：麥慶雲
- 依託單位：中山大學
中文摘要,結題摘要,
中文摘要
利用小分子化合物製備IPSC是目前個體化幹細胞研究領域中的熱點，由於傳統小分子化合物篩選隨機性強、目標性差和工作量大，且現有製備誘導性多能幹細胞(IPSC)的方法因可能引起基因突變、表達失控以及轉化效率低等缺陷而制約其未來臨床套用。雙鏈小分子RNA具備可序列特異性地增強目標基因的表達水平、並且作用強烈與持續時間可的特點。據此，本課題組前期試驗最佳化並篩選出可特異、高效誘導SOX2、OCT4、KLF4等幹細胞核心轉錄因子基因上調錶達的小分子RNA序列，並擬套用於建立誘導性多能幹細胞的新方法，從而避免基因插入所致IPSC的基因突變與表達失控，並進一步探討套用該方法從有核血細胞或上皮細胞製備患者個體化的誘導性多能幹細胞的可行性。本項目利用小分子RNA調控幹細胞核心轉錄因子表達用於誘導性多能幹細胞，對未來IPSC的臨床安全套用提供了一個新的研究思路。
結題摘要
近些年來，誘導性多能幹細胞（IPSCs）的研究製備取得了突飛猛進的發展，從病毒方法到非病毒的轉座子載體和蛋白質均能介導外源轉錄因子誘導產生IPSCs。但是利用病毒載體誘導IPS細胞時，會引起外源基因整合到體細胞基因組，引起插入突變而存在安全隱患。而轉座系統將外源基因整合到細胞中誘導IPSCs後再將外源基因敲除，此方法效率雖高於病毒轉染，但驗證基因組不存在外源基因過程繁瑣，且基因敲除後，轉座酶識別點有基因重排的發生。因此，尋找一種高效安全製備誘導性多能幹細胞的方法是幹細胞研究的熱點和難點。 本項目基於前期研究結果，篩選最佳化出具有特殊結構並且可特異、高效、持續地誘導c-MYC、KLF4等目標基因（幹細胞特異性表達基因）上調錶達的功能小片段RNA分子。這類小分子化合物是針對c-MYC、KLF4等基因的5’非編碼區啟動子序列或轉錄起始位點及其側翼序列，設計、合成並篩選出可誘導上述目標基因特異、高效上調錶達的小片段RNA序列。我們最終確定基於目的基因KLF4的小分子RNA序列為KLF4-496和 KLF4-514，基於目的基因CMYC的小分子RNA序列為c-MYC-322和 c-MYC-787。實驗結果顯示，同一目標基因的候選小分子在不同細胞系中表達作用不同。其中ds-KLF4-496導入Caco2細胞中後目標基因的表達量最高，與對照組相比表達量高於5倍；而KLF4-514的小分子RNA在不同結腸癌細胞系中表達量無明顯差異。為進一步探究小分子RNA在腫瘤細胞和正常細胞中的作用，我們將高表達的ds-KLF4-496轉染到正常人胚胎腎臟細胞株HEK293中，結果顯示ds-KLF4-496並不能促進HEK293細胞中KLF4基因的表達。由此可知，小分子RNA活化具有序列和細胞特異性，對於構建利用小分子RNA製備個體化誘導性幹細胞具有重要意義。此外，我們構建了無異源人包皮成纖維-合成培養基的新型培養體系，與傳統培養基相比，具有長期維持幹細胞自我更新、多能性及無限增殖等優勢，為幹細胞的臨床套用奠定了基礎。 綜上所述，利用小分子RNA活化促進幹細胞特異性基因高表達及培養條件的最佳化可長期、穩定的進行幹細胞的誘導和培養工作，有效降低了病毒、生物大分子轉染髮生的基因突變及轉染率低等問題，穩定了幹細胞形態、增殖等特性，對幹細胞的研究提供了新的途徑。
