《分離魚類GABA受體及其農藥安全性靶標研究》是依託上海師範大學，由任天瑞擔任項目負責人的面上項目。
基本介紹
- 中文名：分離魚類GABA受體及其農藥安全性靶標研究
- 項目類別：面上項目
- 項目負責人：任天瑞
- 依託單位：上海師範大學
項目摘要,結題摘要,
項目摘要
課題針對氟蟲腈對魚類高毒性問題，研究魚類GABA受體分離方法，培養GABA受體晶體，分析受體的結構與功能，確定配體與受體作用方式，闡明提高農藥對魚類安全性的分子作用機理，建立GABA受體抑制劑的魚毒體外篩選方法。選擇Ro7-1986（經典配體）和Fipronil為配體，連線在瓊脂糖上製備親和柱，通過親和色譜、離子色譜，純化和富集獲得GABA受體蛋白，建立高純度、高收率的靶標分離方法。接枝Fipronil和螢光標記物RB200到水溶性聚合物上，作為螢光探針，並與氟譜聯合，鑑定Fipronil相關受體亞基，測定胺基酸序列，製備配體受體複合物。利用螢光分光光度法，建立新的GABA受體與配體的結合常數分析方法。透析法培養複合物晶體，X光譜分析晶體學基礎數據，確定配體受體相互作用位置。採用計算機模擬技術分析魚類與昆蟲的GABA受體與配體相互作用的結構差異，為合成綠色農藥提供理論指導。
結題摘要
本項目旨在分離魚類 GABA 受體蛋白並研究其與農藥小分子的相互作用，從而進一步解釋該靶標蛋白與殺蟲劑的相互作用機理，為新農藥的合成提供理論依據。針對這一目標首先製備了Ro7-1986及氟蟲腈親和柱，然後用親和柱分離魚類GABA受體，並成功分離純化了鱅魚GABA受體。此外以Ro7-1986、氟蟲腈(Fipronil)和異硫氰酸螢光素(FITC)為原料合成了兩種 GABA受體的配體螢光探針。採用螢光標記法及計算機模擬法研究了Fipronil與魚腦內GABA受體的相互作用，闡明了氟蟲腈對魚類高毒性的機理。 本研究的研究結論如下：（1）採用了螢光標記法測定蛋白大分子與農藥小分子的親和常數。研究結果表明，Ro7-1986和氟蟲腈與受體的親和常數Kd分別為67±5nM和346±6nM，最大結合量[RT]值分別為13.8±1.8 pmol/mg protein和40.6±3.5 pmol/mg protein。（2）採用同源建模的方法構建了斑馬魚γ-氨基丁酸A型(GABAA)受體和果蠅RDL(resistance to dieldrin)受體跨膜區的三維結構，研究了氟蟲腈在兩個受體中作用位點的差異；採用分子對接和分子動力學方法，探討了氟蟲腈與斑馬魚GABAA受體和果蠅RDL受體的結合模式，並比較了氟蟲腈與兩個受體作用的差異性。結果表明：斑馬魚GABAA受體和氟蟲腈作用位點的結構與果蠅RDL受體和氟蟲腈作用位點的結構存在一定的差異，果蠅RDL受體的Ala301對應斑馬魚GABAA受體α1亞基的Val284和γ2亞基的Ser306，胺基酸構象的差異較大；氟蟲腈與斑馬魚GABAA受體的結合位點靠近胞內區一端，而與果蠅RDL受體的結合位點則位於受體第二跨膜區的Ala301~Leu308區域內。複合物分子動力學模擬結果表明，在模擬過程中，兩個受體與氟蟲腈複合物體系的勢能很快達到平衡狀態。斑馬魚GABAA受體與氟蟲腈之間形成4個氫鍵，其中機率大於60%的氫鍵有2個；而果蠅RDL受體與氟蟲腈形成了6個氫鍵，但只有1個氫鍵的機率大於50%，其複合物結合的穩定性比前者低。
