《分子改造Levan蔗糖酶拓展轉糖基底物特異性研究》是依託山東大學，由肖敏擔任項目負責人的面上項目。
基本介紹
- 中文名：分子改造Levan蔗糖酶拓展轉糖基底物特異性研究
- 項目類別：面上項目
- 項目負責人：肖敏
- 依託單位：山東大學
中文摘要,結題摘要,
中文摘要
結構多樣的寡糖庫是糖基化修飾和糖鏈探針研究的基礎。糖的多個羥基使特異糖苷合成的化學法步驟繁瑣，套用難度大。生物酶法中的糖苷酶法糖基供體為簡單糖類且糖基受體多樣，工業實用性較好。Levan蔗糖酶能以蔗糖為底物轉果糖基合成β-2,6果糖苷鍵組成的Levan類寡糖和聚糖。微生物來源的Levan蔗糖酶合成寡糖和聚糖的比例不同，表現出底物特異性差異，該特性是由酶分子中的某些胺基酸決定的。我們已經篩選到一株高產Levan聚糖的地衣芽胞桿菌，本項目進行該菌株Levan蔗糖酶的分離純化和轉糖基研究，酶基因克隆後序列分析推測酶分子中與轉糖基反應的底物特異性可能有關的胺基酸，定點飽和突變建立突變酶庫，篩選獲得轉糖基底物特異性拓展的突變酶。本項目完成不僅可填補國際上地衣芽胞桿菌Levan蔗糖酶系統研究的空白，而且轉糖基底物特異性拓展的突變酶可作為酶法合成寡糖或糖苷化合物的有力工具，推進糖基化工程和糖藥物的研發。
結題摘要
Levan蔗糖酶能以蔗糖為底物轉果糖基合成β-2,6果糖苷鍵連線的果寡糖和果聚糖。微生物來源的Levan蔗糖酶合成寡糖和聚糖的比例不同，表現出底物特異性差異。本項目分離純化了地衣芽孢桿菌8-37-0-1的Levan蔗糖酶，分子量約為50kDa，N-端胺基酸序列為KETQDYKKSY。該酶在0.8M的蔗糖溶液（pH 6.5）中，40℃反應24h，合成的Levan果聚糖分子量為2千萬，反應48h後，Levan果聚糖的分子量穩定在4 百萬。PCR擴增得到8-37-0-1菌株的Levan蔗糖酶基因sacB（GenBank No. KF647836），為1446bp，編碼482個胺基酸，理論分子量為53.7kDa，第30-39個胺基酸序列完全對應於純化獲得的天然Levan蔗糖酶N-端胺基酸序列。分別將sacB和sacB-30在大腸桿菌中重組表達，表達sacB的重組菌培養液上清和細胞中均有酶活，而表達sacB-30的重組菌培養液上清沒有酶活，細胞內有酶活。重組酶分別經鎳親和純化，SDS-PAGE結果顯示重組SacB-30蛋白為單一帶（58kDa），重組SacB蛋白為兩條帶（51kDa和60kDa），蛋白肽指紋圖分析結果均為Levan蔗糖酶。與天然酶相同條件下反應24h，重組SacB-30合成的Levan果聚糖分子量為1千萬，反應48h後，果聚糖分子量與天然酶相同，反應中還生成少量果寡糖，鑑定其中三糖為新蔗果三糖（neokestose）和1-蔗果三糖（1-kestose）。重組酶具有廣泛的糖基受體底物特異性，能以多種單糖、寡糖、糖醇、多種酚類及短鏈烷基醇類化合物為糖基受體合成果糖苷。分離獲得了4種轉糖基產物，果糖基分別以β(2,1)連線到糖受體上，顯示出該酶以其他單糖和寡糖為轉糖基受體合成果糖苷時具有顯著不同於合成Levan果聚糖時的優選β(2,6)區域選擇性。生物信息分析推測了Levan蔗糖酶與轉糖基反應底物特異性可能有關的胺基酸位點，定點突變篩選獲得的六種突變酶都喪失或降低了合成果聚糖的能力，均合成3-8不同聚合度的果寡糖，純化了9種3-8聚合度寡糖，結構解析發現所有突變酶均改變了糖合成的聚合度，但不改變原始酶合成果聚糖時優勢的β(2,6)區域選擇性。
