兼性金屬型植物酸性轉化酶基因的變異與功能研究

《兼性金屬型植物酸性轉化酶基因的變異與功能研究》是依託武漢大學，由熊治廷擔任項目負責人的面上項目。

基本介紹

• 中文名：兼性金屬型植物酸性轉化酶基因的變異與功能研究
• 項目類別：面上項目
• 項目負責人：熊治廷
• 依託單位：武漢大學

項目摘要

酸性轉化酶因水解蔗糖提供能量、碳源和己糖信號是植物庫器官建成的關鍵酶，對重金屬污染極端環境中金屬型植物生根、結實和抗性維持的特殊生活史形成有重要作用。近期發現，多種金屬型植物抗銅種群的該酶基因發生趨異，使酶蛋白出現胺基酸替換、酶-底物親合力提高且酶活性升高。但未知這些胺基酸替換是否與酶活性增強相關、其中哪些殘基是關鍵功能位點？本項目用RT-PCR、PCR定點突變、重組質粒構建、畢赤酵母和擬南芥異源表達、重組蛋白酶學特徵和3D構型及轉基因植株表型分析，研究商周古銅礦遺址原產兼性金屬型植物酸性轉化酶基因若干關鍵位點突變與其酶學特徵及功能變異的關係，藉此從一側面闡述該酶的變異在抗銅種群特殊生活史形成和進化中的作用。本項目經比較酸性轉化酶基因定點突變體與其野生型的異源表達蛋白的酶學特徵和功能差異，能在實驗室內藉助基因操作手段驗證該酶在野外可能發生的進化過程。此思路可為其它類似的進化生態學研究借鑑。

結題摘要

金屬型植物是生長在重金屬污染區、具有抗重金屬性能的植物。它們在植物抗重金屬機理與進化、重金屬污染土壤的植物修復和生態恢復研究中具有突出地位。酸性轉化酶因水解蔗糖提供能量、碳源和己糖信號是植物庫器官建成的關鍵酶，對污染環境中金屬型植物生根、結實和抗性維持的特殊生活史形成有重要作用。本項目以我國銅礦污染區原產金屬型植物為試材，套用RT-PCR、3'和5'RACE、DNA測序、實時定量PCR、SDS-PAGE、Western Blot、酶蛋白三維模擬、巴斯德畢赤酵母及擬南芥異源表達等技術，比較分析銅礦污染區抗銅種群和對照區非抗銅種群酸性轉化酶基因的結構與功能變異。研究的金屬型植物包括海洲香薷、雞眼草和齒果酸模。酸性轉化酶包括細胞壁轉化酶和液泡轉化酶。研究內容涉及三個物種的酸性轉化酶基因克隆與轉錄表達，酶蛋白3D結構、模擬定點突變和分子對接，異源表達，重組蛋白的酶學特徵，及啟動子的變異和活性。三個物種的抗銅種群的酸性轉化酶基因表達無例外地受銅脅迫誘導，而非抗銅種群則被抑制。三個物種的抗銅種群和非抗銅種群之間酸性轉化酶蛋白有2-3個胺基酸殘基趨異，但這些趨異的胺基酸並不位於酶分子的催化活性中心，也沒有顯著改變酶分子的構型。海洲香薷和雞眼草的酸性轉化酶基因在畢赤酵母中異源表達獲得重組蛋白，其酶學特性及對多種重金屬的敏感性在抗銅種群和非抗銅種群之間沒有明顯差異。因此，抗銅種群酸性轉化酶基因編碼區的趨異沒有對其功能產生顯著影響。在海洲香薷酸性轉化酶基因啟動子序列中發現多個與植物激素、生物和非生物脅迫及糖相關的順式調控元件，這意味著酸性轉化酶基因的表達調控可能受到這些因素的廣泛影響。海洲香薷酸性轉化酶基因啟動子在轉基因擬南芥中成功驅動GUS報告基因表達。本項目研究結果初步證實抗銅種群酸性轉化酶基因編碼區的趨異對其酶學特徵和基因表達沒有產生顯著影響，而其由啟動子介導的基因表達調控變異值得深入研究。