兩染細胞涉及心肌肥大相關的MR－1基因功能，領域為細胞學，有望治療心肌肥大相關疾病。
基本介紹
- 中文名：兩染細胞
- 涉及：心肌肥大相關的MR－1基因功能
- 領域：細胞學
- 作用：有望治療心肌肥大相關疾病
兩染細胞其涉及與心肌肥大相關的MR－1基因功能，動物體內實驗證明了該基因的高表達，其加劇了AngⅡ對心肌肥大、炎症及纖維化的作用，證明MR－1的作用機制是通過對核因子NF－κB信號通路的調控，干擾MR－1的表達可以降低和削弱AngⅡ對NF－κB信號通路的誘導，說明降低或阻斷MR－1基因的表達，有望成為治療心肌肥大相關疾病的新靶點。
兩染細胞心肌細胞肥大(cardiomyocytehypertrophy)是高血壓、心臟瓣膜病、急性心肌梗塞及先天性心臟病等臨床常見疾病的一種併發症，是心肌細胞對多種病理刺激的一種適應性反應。目前雖然認為心肌肥大的發病機制與細胞外的心肌肥大因子刺激、細胞內的信號轉導和核內的某些基因活化有關，但其最本質的特徵是心肌細胞基因表達的異常。大量研究表明，肥大因子刺激30min即可誘發一系列即刻早期反應基因，如c-fos、c-myc、c-jun、egr-1等進行表達，其後一些心肌肥大標誌基因，如MHC、ANF、BNP等被活化，最後是一些心肌收縮蛋白基因，如MLC-2、α-actin等表達上調。近年證實，無論何種刺激信號，往往都是通過激活一系列與心肌肥大發生相關的轉錄因子，包括Spl、Elk-1、SRF、MEF-2、GATA-4和LIM等而誘發心肌肥大的發生。LIM蛋白是一類富含半胱氨酸且分子結構中具有一個或多個鋅指結構的蛋白質家族，該家族成員廣泛參與多種細胞的發育與分化調節及多種基因的轉錄調控。hhlim是新近從胎兒心臟中分離和克隆的與心臟發生相關的基因，因其編碼產物與LIM蛋白家族高度同源且胺基酸序列中含有典型的LIM結構域而得名。目前發現，hhlim在自發性高血壓大鼠和心肌肥厚大鼠的心肌細胞中表達活性增強，但對其是否直接參與心肌細胞肥大的發生過程及作用機制還不清楚。本文在對hhlim基因表達調控機制進行研究的基礎上，從整體、細胞和分子水平上探討該基因在心肌肥大發生髮展中的意義及其作用機制。
1hhlim表達調控機制的研究
hhlim是用三元遞減法從人胎心cDNA文庫中篩選克隆到一個與心臟生長發育有關的新基因。為了探討hhlim基因的表達調控機制，將該基因5’側翼區(長約2550bp)不同長度的片段與螢光素酶報告基因重組後，轉染小鼠成肌細胞C2C12，確定其表達調控區域，並在此基礎上，觀察內皮素-1(ET-1)和鹼性成纖維細胞生成長因子(bFGF)對該基因表達的影響。實驗結果如下：
1.1在被馬血清誘導(分化型)或不誘導(未分化型)的C2C12細胞中，從hhlim基因5’上游-2537bp序列依次進行缺失的9種不同長度的DNA片段均可驅動螢光素酶表達，其中，以轉錄起始點至5’上游-253bp(pF8)驅動螢光素酶基因表達的活性最高，比-2537bp(pF1)高9.9倍，比-157bp(pF9)高2.95倍。除-2037bp(pF2)片段的活性與-157bp(pF9)相近外，其它片段均有較高的活性。兩種表型的C2C12細胞相比，除pF2和pF8之外，其它片段驅動螢光素酶表達的活性在分化型細胞均高於未分化型細胞。
1.2EMSA表明，從分化型和未分化型C2C12細胞中提取的核蛋白都可與hhlim基因上游-293～+16bp片段相結合，在4%PAGE上前者出現兩條滯後帶，後者出現一條滯後帶，由此說明，兩種表型細胞的核蛋白中均含有與-293～+16bp片段特異性結合的蛋白因子，但蛋白因子的種類和/或與順式元件的相互作用方式可能不同。
1.3用在分化型C2C12細胞中表達活性較高的pF5轉染C2C12細胞，在用馬血清誘導被轉染細胞進行分化的同時，加入心肌細胞肥大刺激因子ET-1和bFGF，觀察兩種因素對報告基因表達的影響。結果顯示，ET-1和bFGF作用於C2C12細胞24h後，螢光素酶活性在被ET-1刺激的細胞中顯著升高(達未刺激細胞的1.6倍)，至48h，其活性仍高於對照細胞；bFGF雖然也能促進螢光素酶表達，但螢光素酶活性升高的幅度在24h低於被ET-1刺激的細胞，在48h，略高於被ET-1刺激的活性。
1.4RT-PCR結果顯示，處於分化過程中的C2C12細胞被ET-1和bFGF刺激後，hhlim表達活性分別於12h和6h開始升高，24h和48h達到高峰，在該時間點，其表達活性分別比對照細胞高出4.5倍和3.38倍。
上述結果提示，轉錄起始點至5’上游-253bp在該基因表達調控中起重要作用，其順式作用元件與轉錄因子相互作用具有多樣性和複雜性，該基因表達受ET-1和bFGF的調節。
2hhlim基因表達產物的亞細胞定位及其在細胞肥大中的意義
hhlim作為與心臟生長發育有關的基因被克隆，並發現其在自發性高血壓大鼠和心肌肥厚大鼠的心肌細胞中表達活性增強。然而，關於hhlim是否能直接引起心肌細胞肥大及其引起心肌細胞肥大的作用機制還不明了。本部分實驗以與心肌細胞結構相似且易於轉染外源基因的小鼠成肌細胞C2C12為強制性表達外源性hhlim基因的細胞，觀察hhlim基因表達產物的亞細胞定位及其在細胞肥大中的作用。結果如下：
2.1用脂質體轉染方法將真核表達載體攜帶的外源性hhlim基因導入處於分化過程中的C2C12細胞，證實該基因強制性表達可使C2C12細胞體積明顯增大。
2.2Westernblot分析結果顯示，在未分化型C2C12細胞中檢測不到α-actin的存在，未分化型C2C12細胞被外源性hhlim轉染後，α-actin出現低量表達，說明hhlim強制性表達可誘導未分化型C2C12細胞表達α-actin；在被馬血清誘導分化的C2C12細胞中，hhlim強制性表達使α-actin含量急劇增加，比未分化型細胞增加8.07倍，比未轉染hhlim的細胞升高1.71倍。
2.3RT-PCR結果顯示，在未分化型C2C12細胞中BNP表達活性較高，在被馬血清誘導分化成熟的C2C12細胞中BNP不表達，C2C12細胞被外源性hhlim轉染後再經馬血清誘導時，該基因的表達又被顯著誘導。
2.4用綠色螢光蛋白-hhlim融合蛋白表達載體轉染處於分化過程的C2C12細胞，發現轉染不同時間，表達產物的亞細胞定位發生動態變化，表現為先在胞核和胞質中均有分布，而後定位於胞質的變化規律。在ET-1誘導下，內源性hhlim的亞細胞定位也發生動態變化，表現為誘導24h時，hhlim蛋白在細胞質和細胞核中均有分布，但主要集中分布在胞核中，誘導48h後，細胞核中的紅色螢光明顯減弱，胞質螢光強度顯著增強。
2.5以hhlim抗體和蛋白A-Sepharose對C2C12細胞裂解液進行免疫沉澱後，用抗α-actin抗體進行Westernblot分析的結果表明，在分化型細胞，hhlim抗體可以使α-actin共沉澱，即沉澱物中出現明顯的α-actin條帶；在轉染hhlim後的分化型細胞，條帶明顯加深；轉染hhlim的未分化型細胞中α-actin條帶很淺，在未分化型C2C12細胞中檢測不到α-actin的存在。免疫雙螢光分析結果顯示，TRITC標記的hhlim蛋白與FITC標記的α-actin螢光相互重合為黃色螢光。提示，hhlim在胞質中以與α-actin相互締合的方式存在。
上述結果提示，在C2C12細胞從未分化型向分化型轉化的早期，hhlim蛋白主要存在於核內，此時可能發揮啟動心肌細胞肥大相關基因表達的作用；在分化型細胞中，hhlim蛋白主要分布於胞質中，胞質中的hhlim可能以與α-actin相互締合的方式參與細胞骨架的構成。
3hhlim對心肌肥大的影響及其作用機制探討
第二部分研究表明，hhlim具有啟動C2C12細胞肥大相關基因表達及引發細胞肥大的作用。為進一步研究其是否也能引起心肌細胞肥大，本部分用攜帶hhlimcDNA的真核表達載體轉染心肌細胞後，觀察其強制性表達對心肌肥大的影響，並通過檢測心肌細胞肥大相關基因表達的變化，探討hhlim致心肌肥大的作用機制。實驗結果如下：
3.1在原代心肌細胞中，hhlim基因表達活性較低，ET-1作用48h後，其表達被顯著誘導，表達活性達對照細胞的2.12倍。BNPmRNA在原代培養的細胞中不能被檢出，ET-1作用於細胞48h或轉染hhlim基因48h後，BNP表達活性顯著升高。
3.2RT-PCR結果表明，心肌細胞被可表達hhlim反義RNA的重組質粒轉染後，BNP的表達明顯下調，其表達活性比相應對照細胞降低了71%。Westernblot結果顯示，hhlim強制性表達可使心肌細胞α-actin水平比轉染空載體的細胞升高146.05%，轉染反義hhlim後，α-actin含量比相應對照細胞下降61.97%。
3.4hhlim在原代心肌細胞中的強制性表達
1hhlim表達調控機制的研究
hhlim是用三元遞減法從人胎心cDNA文庫中篩選克隆到一個與心臟生長發育有關的新基因。為了探討hhlim基因的表達調控機制，將該基因5’側翼區(長約2550bp)不同長度的片段與螢光素酶報告基因重組後，轉染小鼠成肌細胞C2C12，確定其表達調控區域，並在此基礎上，觀察內皮素-1(ET-1)和鹼性成纖維細胞生成長因子(bFGF)對該基因表達的影響。實驗結果如下：
1.1在被馬血清誘導(分化型)或不誘導(未分化型)的C2C12細胞中，從hhlim基因5’上游-2537bp序列依次進行缺失的9種不同長度的DNA片段均可驅動螢光素酶表達，其中，以轉錄起始點至5’上游-253bp(pF8)驅動螢光素酶基因表達的活性最高，比-2537bp(pF1)高9.9倍，比-157bp(pF9)高2.95倍。除-2037bp(pF2)片段的活性與-157bp(pF9)相近外，其它片段均有較高的活性。兩種表型的C2C12細胞相比，除pF2和pF8之外，其它片段驅動螢光素酶表達的活性在分化型細胞均高於未分化型細胞。
1.2EMSA表明，從分化型和未分化型C2C12細胞中提取的核蛋白都可與hhlim基因上游-293～+16bp片段相結合，在4%PAGE上前者出現兩條滯後帶，後者出現一條滯後帶，由此說明，兩種表型細胞的核蛋白中均含有與-293～+16bp片段特異性結合的蛋白因子，但蛋白因子的種類和/或與順式元件的相互作用方式可能不同。
1.3用在分化型C2C12細胞中表達活性較高的pF5轉染C2C12細胞，在用馬血清誘導被轉染細胞進行分化的同時，加入心肌細胞肥大刺激因子ET-1和bFGF，觀察兩種因素對報告基因表達的影響。結果顯示，ET-1和bFGF作用於C2C12細胞24h後，螢光素酶活性在被ET-1刺激的細胞中顯著升高(達未刺激細胞的1.6倍)，至48h，其活性仍高於對照細胞；bFGF雖然也能促進螢光素酶表達，但螢光素酶活性升高的幅度在24h低於被ET-1刺激的細胞，在48h，略高於被ET-1刺激的活性。
1.4RT-PCR結果顯示，處於分化過程中的C2C12細胞被ET-1和bFGF刺激後，hhlim表達活性分別於12h和6h開始升高，24h和48h達到高峰，在該時間點，其表達活性分別比對照細胞高出4.5倍和3.38倍。
上述結果提示，轉錄起始點至5’上游-253bp在該基因表達調控中起重要作用，其順式作用元件與轉錄因子相互作用具有多樣性和複雜性，該基因表達受ET-1和bFGF的調節。
2hhlim基因表達產物的亞細胞定位及其在細胞肥大中的意義
hhlim作為與心臟生長發育有關的基因被克隆，並發現其在自發性高血壓大鼠和心肌肥厚大鼠的心肌細胞中表達活性增強。然而，關於hhlim是否能直接引起心肌細胞肥大及其引起心肌細胞肥大的作用機制還不明了。本部分實驗以與心肌細胞結構相似且易於轉染外源基因的小鼠成肌細胞C2C12為強制性表達外源性hhlim基因的細胞，觀察hhlim基因表達產物的亞細胞定位及其在細胞肥大中的作用。結果如下：
2.1用脂質體轉染方法將真核表達載體攜帶的外源性hhlim基因導入處於分化過程中的C2C12細胞，證實該基因強制性表達可使C2C12細胞體積明顯增大。
2.2Westernblot分析結果顯示，在未分化型C2C12細胞中檢測不到α-actin的存在，未分化型C2C12細胞被外源性hhlim轉染後，α-actin出現低量表達，說明hhlim強制性表達可誘導未分化型C2C12細胞表達α-actin；在被馬血清誘導分化的C2C12細胞中，hhlim強制性表達使α-actin含量急劇增加，比未分化型細胞增加8.07倍，比未轉染hhlim的細胞升高1.71倍。
2.3RT-PCR結果顯示，在未分化型C2C12細胞中BNP表達活性較高，在被馬血清誘導分化成熟的C2C12細胞中BNP不表達，C2C12細胞被外源性hhlim轉染後再經馬血清誘導時，該基因的表達又被顯著誘導。
2.4用綠色螢光蛋白-hhlim融合蛋白表達載體轉染處於分化過程的C2C12細胞，發現轉染不同時間，表達產物的亞細胞定位發生動態變化，表現為先在胞核和胞質中均有分布，而後定位於胞質的變化規律。在ET-1誘導下，內源性hhlim的亞細胞定位也發生動態變化，表現為誘導24h時，hhlim蛋白在細胞質和細胞核中均有分布，但主要集中分布在胞核中，誘導48h後，細胞核中的紅色螢光明顯減弱，胞質螢光強度顯著增強。
2.5以hhlim抗體和蛋白A-Sepharose對C2C12細胞裂解液進行免疫沉澱後，用抗α-actin抗體進行Westernblot分析的結果表明，在分化型細胞，hhlim抗體可以使α-actin共沉澱，即沉澱物中出現明顯的α-actin條帶；在轉染hhlim後的分化型細胞，條帶明顯加深；轉染hhlim的未分化型細胞中α-actin條帶很淺，在未分化型C2C12細胞中檢測不到α-actin的存在。免疫雙螢光分析結果顯示，TRITC標記的hhlim蛋白與FITC標記的α-actin螢光相互重合為黃色螢光。提示，hhlim在胞質中以與α-actin相互締合的方式存在。
上述結果提示，在C2C12細胞從未分化型向分化型轉化的早期，hhlim蛋白主要存在於核內，此時可能發揮啟動心肌細胞肥大相關基因表達的作用；在分化型細胞中，hhlim蛋白主要分布於胞質中，胞質中的hhlim可能以與α-actin相互締合的方式參與細胞骨架的構成。
3hhlim對心肌肥大的影響及其作用機制探討
第二部分研究表明，hhlim具有啟動C2C12細胞肥大相關基因表達及引發細胞肥大的作用。為進一步研究其是否也能引起心肌細胞肥大，本部分用攜帶hhlimcDNA的真核表達載體轉染心肌細胞後，觀察其強制性表達對心肌肥大的影響，並通過檢測心肌細胞肥大相關基因表達的變化，探討hhlim致心肌肥大的作用機制。實驗結果如下：
3.1在原代心肌細胞中，hhlim基因表達活性較低，ET-1作用48h後，其表達被顯著誘導，表達活性達對照細胞的2.12倍。BNPmRNA在原代培養的細胞中不能被檢出，ET-1作用於細胞48h或轉染hhlim基因48h後，BNP表達活性顯著升高。
3.2RT-PCR結果表明，心肌細胞被可表達hhlim反義RNA的重組質粒轉染後，BNP的表達明顯下調，其表達活性比相應對照細胞降低了71%。Westernblot結果顯示，hhlim強制性表達可使心肌細胞α-actin水平比轉染空載體的細胞升高146.05%，轉染反義hhlim後，α-actin含量比相應對照細胞下降61.97%。
3.4hhlim在原代心肌細胞中的強制性表達
