人工細胞合成5α-羥化紫杉二烯的P450羥化酶特異性研究

人工細胞合成5α-羥化紫杉二烯的P450羥化酶特異性研究

《人工細胞合成5α-羥化紫杉二烯的P450羥化酶特異性研究》是依託天津大學,由李霞擔任項目負責人的青年科學基金項目。

基本介紹

  • 中文名:人工細胞合成5α-羥化紫杉二烯的P450羥化酶特異性研究
  • 項目類別:青年科學基金項目
  • 項目負責人:李霞
  • 依託單位:天津大學
項目摘要,結題摘要,

項目摘要

人工細胞生產紫杉醇關鍵前體過程中存在副產物多,轉化率低等問題,是制約利用人工細胞進行紫杉醇前體工業化大生產的瓶頸。申請者提出基於定向進化和半理性設計策略,對紫杉二烯5α羥化酶特異性進行改進,進而減少副產物、提高轉化率以解決上述問題。本研究以催化紫杉醇關鍵前體紫杉二烯生成5α-羥基紫杉二烯的紫杉二烯5α-羥化酶為研究對象,嘗試進行如下研究:採用多輪隨機突變構建5α羥化酶的突變文庫,高通量篩選5α-羥化紫杉二烯為主產物的高產菌株,獲得突變位點;分子模擬結合定點飽和突變對5α羥化酶進行半理性設計,篩選突變酶;快速篩選上述突變位點隨機組合獲得的菌株並對突變體酶的表達條件進行最佳化;通過分子模擬解析突變酶催化產物組成發生改變的機制,揭示造成人工細胞合成5α-羥基紫杉二烯專一性差的原因,探索強化5α羥化酶催化特異性機制。該研究將為人工細胞高效合成紫杉醇前體、滿足日益增長的需求提供技術基礎。

結題摘要

人工細胞生產紫杉醇關鍵前體過程中存在副產物多,轉化率低等問題,是制約利用人工細胞進行紫杉醇前體工業化大生產的瓶頸。本項目圍繞催化紫杉醇關鍵前體紫杉二烯生成5α羥化紫杉二烯醇的紫杉二烯5α羥化酶體系展開研究。對涉及5α羥化紫杉二烯醇生物合成路徑中各功能元件選擇多個來源並最佳化,通過模組化組合設計獲得了不同功能元件組合最佳化下的前體合成定量情況。通過半理性設計,採用N端穿膜工程引入不同來源和不同長度N端截短的紫杉二烯5α羥化酶與P450還原酶組合融合表達,發現紫杉二烯5α羥化酶的截短不超過42aa,可強化5α羥化酶催化特異性更利於5α羥化紫杉二烯醇的產生。該研究結果表明,利用組合設計策略研究模組間相互作用及其與底盤間適配性將為在微生物細胞中實現細胞色素P450酶系介導的催化反應過程提供重要參考,也為人工細胞高效合成紫杉醇前體、滿足日益增長的需求提供技術基礎。
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