人卵母細胞線粒體DNA置換及其臨床研究

《人卵母細胞線粒體DNA置換及其臨床研究》是依託中山大學，由丁晨暉擔任項目負責人的青年科學基金項目。

基本介紹

• 中文名：人卵母細胞線粒體DNA置換及其臨床研究
• 項目類別：青年科學基金項目
• 項目負責人：丁晨暉
• 依託單位：中山大學

中文摘要

由線粒體DNA突變所導致的疾病是一種母性遺傳疾病，迄今沒有十分有效的治療方法。以Leber遺傳性視神經病（LHON）為模型，利用人卵母細胞體外成熟和紡錘體移植技術建立線粒體置換的來源的胚胎幹細胞系，探索避免線粒體疾病遺傳和進行替代性治療的新途徑。通過建立受精來源的胚胎幹細胞檢測線粒體置換胚胎髮育成個體的潛能，為避免線粒體DNA突變疾病的遺傳進行初步的探索。在此過程中，利用活細胞螢光技術，mRNA晶片技術，螢光原位雜交技術檢測不同紡錘體移植技術的安全性和有效性，為其套用於臨床做進一步探索。線粒體置換來源的孤雌激活胚胎幹細胞系對患者來說是沒有免疫原性的，在其分化之後有可能為線粒體突變疾病患者進行細胞替代治療。通過將ST來源的孤雌胚胎幹細胞定向誘導分化後移到LHON模型小鼠的視網膜，檢測其對受損視網膜神經節細胞的替代和修復，為人卵母細胞紡錘體移植技術套用於臨床解除女性患者的病痛進行初步探索。

結題摘要

線粒體是真核生物的重要細胞器之一，是一種自身帶有遺傳物質（mtDNA）的半自主細胞器，也細胞內氧化磷酸化和形成ATP的主要場所,有細胞動力工廠 之稱。線粒體病是遺傳缺損引起線粒體代謝酶缺陷，使ATP合成障礙、能量來源不足導致的一組異質性病變。迄今為止，mtDNA引起疾病的治療主要是支持性療法，迄今尚無十分有效的治療途徑，如何阻斷mtDNA疾病的遺傳，同時尋找有效治療mtDNA突變疾病的手段和尤為重要。mtDNA突變引起的疾病主要是通過母系遺傳影響後代的，mtDNA基本上全部來自於卵母細胞。因此，為了避免mtDNA突變遺傳給後代，在胚胎形成之前或者胚胎早期去除或者替換突變的mtDNA成為首選策略。目前已有研究分別在生髮泡期、MII期以及原核期進行了相應的胞漿移植或核移植研究。此外，建立胞漿移植和核移植來源的胚胎幹細胞系可以替換致病的線粒體，在不久的將來通過使這些胚胎幹細胞分化和移植在一定程度上可以緩解患者的病情。 本研究主要通過利用人成熟卵子進行紡錘體移植（spindle transfer，ST），置換不同來源的卵子的胞漿（包含線粒體），獲得置換mtDNA的成熟卵母細胞，並對發育和遺傳等方面進行安全性評估，為置換mtDNA的卵母細胞進行臨床套用奠定基礎。構建具有發育潛能的紡錘體移植來源的的孤雌激活胚胎，以期通過胚胎幹細胞建系和定向分化系統，獲得mtDNA突變疾病的替代性治療模型，為女性mtDNA突變患者進行替代性治療提供珍貴的原材料。 通過紡錘體移植技術，我們利用直接注射法建立了建立高效的紡錘體移植技術，並抑制了在紡錘體移植過程中的卵子提前激活現象，提高了移植的效率，保證ST卵子的後期發育能力。同時檢測了ST來源的受精和孤雌激活胚胎的具有較好的發育能力，表達多能性基因。通過檢測ST來源的胚胎的基因組完整性，在一定程度上驗證其安全性，為臨床套用打好基礎。此外，我們也發現，胞漿來源對ST胚胎後期發育具有決定性的影響。體外成熟（IVM）來源的胞質不能支持ST胚胎髮育到囊胚，但是IVM來源的紡錘體卻有能力發育到囊胚，這為我們下一步的套用提供了很好的基礎數據。將孤雌激活的ST胚胎的內細胞團分離培養之後建立了一個類胚胎幹細胞系，通過檢測器多能性，基因表達譜和基因印記，我們發現ST來源的孤雌激活ES具有正常的表達的ES標記。雖然早期的基因組保持完整，但是隨著傳代延長出現了染色體