交聯質譜法尋找新型毒素的作用靶點

《交聯質譜法尋找新型毒素的作用靶點》是依託同濟大學，由呂愛平擔任項目負責人的青年科學基金項目。

基本介紹

• 中文名：交聯質譜法尋找新型毒素的作用靶點
• 項目類別：青年科學基金項目
• 項目負責人：呂愛平
• 依託單位：同濟大學

中文摘要

動物毒素是生物製藥研發寶庫。比起化學藥物，毒素類藥物因作用靶點特異性好和不紙轎殃捆上癮不產生抗藥性等優點而備受青睞。但毒素製藥困難重重，其主要瓶頸在於毒素的靶點鑑定，大多數毒素（>95%）我們只知其序列而不知其靶點。傳統研究採用動物模型和電生理實驗來鑑定毒素的作用靶點，該方法只能針對已知的靶點進行篩選，具有很大的局限性。在本項目中，我們將建立一個結合化學交聯和質譜技術來鑑定毒素，主要是芋螺毒素，作用靶點的新方法。毒素多肽與交聯劑共價連線後，與線蟲胚胎單細胞孵育，當毒素與細胞膜上的靶點特異性結合後，誘導交戒煮茅鍵聯劑與靶點進行交聯。毒素-交聯劑-靶點複合物經分離純化後用質譜技術進行靶點鑑定，並驗證靶點生理活性。這個交聯質譜法可以全面無差別地篩選所有與毒素特異性結合的靶點，不僅可以極大地提高靶點鑑定的成功率，還有助於預測毒素在臨床套用過程中可能出現的副作用，進一步提高毒素製藥進入臨床實驗後的的成功率。

結題摘要

過去十多年間，來源於動植物毒素的多肽由於具有作用靶點特異性好和不上癮不產生抗藥性等優點而受到新藥研發相關科研工作者的青睞。雖然在自然界中，天然毒素的多肽序列估計有數百萬之多，但目前已成藥的卻不足雙手之數。究其原因主要有二：一是臨床研究後發現活性不高，或副作用太強等導致失敗，成功率大概在10%左右；二是在基礎研究時，毒素序列被鑑定後，在其功能及作用靶點的研究上進展艱難，目前成功率不足5%。 本項目致力於解決第二個困難，試圖通過結合質譜技術和交聯技術來為毒素的作用靶點研究另闢蹊徑。 本項目篩選毒素作用靶點的主要流程為，首先讓毒素與細胞膜上的可能靶點充分反應，然後採用化學交聯的方法，將空間上相互接近的毒素與靶點交聯，靶點經由化學交聯劑上的特殊標籤（biotin）富集並分離純化，最後用質譜技術來鑑定並篩選毒素的直接作用靶點候選蛋白。項目共合成了四條不同的序列，包括已知靶點的ImI，未知靶點的conomarphin（分別含有苯丙氨酸L型和D型兩種構象），qc16a和ts14a。靶點來源篩選了三種不同的神經細胞，分別為秀麗線蟲胚胎細胞，小鼠海馬神經元細胞系HT22， 和大鼠類芝斷刪交感神經細胞系PC12。 與陰性平行實驗對照後的western blot結果顯示，只有在毒素序列ImI與線蟲胚胎細胞或提店坑HT22細胞的交聯樣本，conomarphin-L與線蟲胚胎細胞的交聯樣本，以及conomarphin-D與HT22細胞的交聯樣本中檢測到了特異性的帶有喇愚盛biotin標籤的條帶，其他的毒素與槳淚挨細胞組合樣本結果皆為陰性。但這幾個有陽性western blot結果的樣本，用streptavidin磁珠富集後進行質譜鑑定，始終未能如願鑑定到靶點蛋白，包括ImI的已知靶點nAChR。後續的實驗證實，毒素-交聯劑-靶點蛋白複合物中的biotin標籤並不能成功結合到磁珠的streptavidin上，我們推測複合物在空間上阻礙了biotin與streptavidin的結合。同理推之，western blot的陰性結果也有可能是由於交聯劑對毒素與靶點的結合造成了空間上的阻礙造成的。 綜上所述，由於空間位阻的原因，本項目所研究的交聯質譜法對於毒素作用靶點的鑑定結果不容樂觀，故屑但也不排除仍有一定的套用前景。