《一種重組長效雞干擾素α的製備方法》是蕪湖英特菲爾生物製品產業研究院有限公司於2016年8月29日申請的發明專利，該專利申請號為201610756022X，公布號為CN106282216A，專利公布日為2017年01月04日，發明人是趙俊、王明麗、趙雨、李樹啟、馬騰飛、符修樂、戚仕梅、高耀輝、賴鵬飛、王利利、汪良青、周煒。
《一種重組長效雞干擾素α的製備方法》涉及一種重組長效雞干擾素α的製備方法，包括：（1）長效雞干擾素α基因的獲取；（2）所述長效雞干擾素α基因連線至原核表達載體pET‑28a上獲得表達載體；（3）所述表達載體轉化大腸桿菌，獲得基因工程菌；（4）所述基因工程菌用IPTG誘導，表達長效雞干擾素α；（5）重組長效雞干擾素α粗製品的製備；（6）重組長效雞干擾素α粗製品的純化。採用該方法製備的重組長效雞干擾素α純度高、活性強、半衰期長。
2020年7月17日，《一種重組長效雞干擾素α的製備方法》獲得安徽省第七屆專利獎銀獎。
（概述圖為《一種重組長效雞干擾素α的製備方法》的摘要附圖）
基本介紹
- 中文名：一種重組長效雞干擾素α的製備方法
- 公布號：CN106282216A
- 公布日：2017年1月4日
- 申請號：201610756022X
- 申請日：2016年8月29日
- 申請人：蕪湖英特菲爾生物製品產業研究院有限公司
- 地址：安徽省蕪湖市經濟技術開發區衡山路35號汽車電子創業園孵化器大樓B0402
- 發明人：趙俊、王明麗、趙雨、李樹啟、馬騰飛、符修樂、戚仕梅、高耀輝、賴鵬飛、王利利、汪良青、周煒
- 代理機構：北京科億智慧財產權代理事務所
- 代理人：湯東鳳
- Int.Cl.：C12N15/70(2006.01)I、C12N1/21(2006.01)I、C07K14/56(2006.01)I、C12R1/19(2006.01)N
- 類別：發明專利
專利背景,發明內容,專利目的,技術方案,改善效果,附圖說明,技術領域,權利要求,實施方式,榮譽表彰,
專利背景
隨著養雞業的發展，中國養雞業已由農村家庭副業發展成了社會一大產業，雞的品種和數量都位於世界前列。正是這迅猛的發展，進而伴隨著很多問題，雞的病毒病日益明顯，如禽流感、雞傳染性法氏囊病、雞傳染性支氣管炎、馬立克氏病和雞新城疫等傳染性疾病，每年都會在不同的季節不同程度的暴發，感染髮病後，初發病急、臨床症狀嚴重、極易傳播擴散以及病死率和死亡率均較高的特點，給養雞業造成巨大經濟損失；不僅如此，因雞與人類生活密切相關，某些病毒性傳染病如禽流感等還會給人類健康帶來潛在威脅。
截至2016年8月，雞病毒性疾病的防治主要採用疫苗免疫和藥物治療，由於疫苗免疫的血清型單一，而病毒的血清型複雜，毒株變異快，常導致疫苗免疫失敗。而一些病毒病甚至尚無疫苗可用。而藥物治療主要使用抗生素，但近年來抗生素的廣泛大量使用導致耐藥性菌株大量產生，並通過食物鏈傳染給人，進而給人類健康帶來更大的威脅。中國從2016年開始明令禁止一些抗生素和抗菌劑在養殖業中的套用。因此，使用干擾素來替代或者部分取代抗生素來積極治療和預防家禽、家畜的病毒性疾病是2016年8月以前最為關注的問題。
干擾素是1957年由Issacs和Lindeman首先發現的一類由病毒及脂多糖等物質誘導機體產生的具有廣譜抗病毒、抗腫瘤和免疫調節作用的多功能的細胞因子，與細胞受體結合後，可誘導機體產生多種特異性蛋白質和酶類，主要通過抑制病毒基因轉錄和降解病毒RNA來抑制病毒的生長繁殖及發揮抗腫瘤等的活性。按照干擾素的產生細胞、生化特徵及在機體免疫方面所發揮的作用不同，分為α、β、γ三種型。截至2016年8月已知，干擾素α在體內可有選擇性地作用於病毒感染細胞，通過抑制受染細胞內的病毒蛋白質的生物合成，發揮廣譜和高效抗病毒作用，但對正常宿主細胞無作用。
截至2016年8月，天然干擾素及人工重組干擾素普遍存在半衰期短的局限，半衰期一般為2-4個小時。半衰期短給治療帶來了極大的不便，治療次數的增加，相應的時間成本及經濟成本隨之增加，而機體的耐受極限也有可能被突破導致不良反應的產生。半衰期短的主要原因有兩個：干擾素的分子量過小在體內代謝過快，干擾素尤其是重組干擾素親和力較差被免疫系統清除。而市面上常見的長效干擾素以聚乙二醇融合干擾素為代表，僅在分子量的層面上部分解決了干擾素分子量小而導致半衰期短的問題。
發明內容
專利目的
《一種重組長效雞干擾素α的製備方法》所要解決的技術問題之一是提供一種重組長效雞干擾素α的製備方法，使得利用該方法製備的重組長效雞干擾素α純度高、活性強、半衰期長。該發明所要解決的另一個技術問題是提供一種基因工程菌，利用該工程菌可以表達重組長效雞干擾素α。
技術方案
《一種重組長效雞干擾素α的製備方法》其特徵在於所述的方法由下列步驟組成：
（1）長效雞干擾素α基因的獲取，所述長效雞干擾素α基因的核苷酸序列如SeqIDNO.3所示；（2）所述長效雞干擾素α基因連線至原核表達載體pET-28a上獲得表達載體；（3）所述表達載體轉化大腸桿菌，獲得基因工程菌；（4）所述基因工程菌用IPTG誘導，表達長效雞干擾素α；（5）重組長效雞干擾素α粗製品的製備；（6）重組長效雞干擾素α粗製品的純化。優選的，所述長效雞干擾素α基因的獲取步驟為：利用引物，從雞肝臟組織中提取RNA進行RT-PCR反應，並將擴增出的雞干擾素α基因及雞血清白蛋白基因通過柔性link連線起來；所述雞干擾素α基因的核苷酸序列如SeqIDNO.1所示；所述雞血清白蛋白基因的核苷酸序列如SeqIDNO.2所示。
優選的，（1）所述雞干擾素α基因的引物序列為：
上游：GAATTCCCCACCATGGCTGTGC
下游：GGCGGCGGCGGCTCCAGTGCGCGTGTTGCCTGTGAGG
上游引物帶有EcoRI酶切位點；下游引物帶有linker；
（2）所述雞血清白蛋白基因的引物序列：
上游：CCGCCGCCGCCGATGAAGTGGGTAAC
下游：CCATGGTTAAGCACCAATTCCTAATGTGGCTCTGCTTTGG
上游引物帶有linker；下游引物帶有NcoI酶切位點。
優選的，所述RT-PCR反應的反應體系為：在25微升的總反應體系中，模板RNA1.5微升，上下游引物各0.5微升，反轉錄酶2.5微升，dNTPMix為10微升，加RNaseFree水至25微升；所述RT-PCR反應的反應條件為：50℃反轉錄30分鐘，95℃預變性4分鐘；94℃變性45秒，58℃退火45秒，72℃延伸1分鐘，循環35次，最後72℃延伸10分鐘。
優選的，所述雞干擾素α基因及雞血清白蛋白基因連線PCR反應體系為：在25微升的總反應體系中，雞干擾素模板DNA1微升、雞血清白蛋白模板DNA1微升，雞干擾素上游引物0.5微升，雞血清白蛋白下游引物0.5微升，轉錄酶2.5微升，dNTPMix為10微升，加RNaseFree水至25微升；連線PCR反應條件為：95℃預變性4分鐘；94℃變性45秒，58℃退火45秒，72℃延伸90秒，循環35次，最後72℃延伸10分鐘。
優選的，所述大腸桿菌為BL21大腸桿菌。
優選的，所述重組長效雞干擾素α粗製品製備的步驟為：離心收集細菌，加入質量體積比1:1的PBS重懸沉澱，－20℃與室溫反覆凍融沉澱3次，4℃超聲裂解細菌沉澱，超聲功率：400瓦，工作10秒，間隔3秒，超聲6分鐘，重複3～4次，4℃離心12000轉/分鐘離心15分鐘分別取上清、沉澱，得到粗製蛋白。優選的，所述重組長效雞干擾素α粗製品純化的步驟為：親和層析；脫鹽、緩衝液置換；離子交換層析；分子篩層析。
利用上述方法構建的基因工程菌，其特徵在於所述基因工程菌可以表達長效雞干擾素α。
利用上述方法製備的重組長效雞干擾素α。
該發明的製備方法為：通過設計特異性引物，從本地肉雞（購自於安徽省實驗動物中心）肝臟組織中提取RNA進行兩種RT-PCR反應，並將擴增出的雞干擾素α基因及雞血清白蛋白基因通過柔性link連線起來，產物經雙酶切後再連線至原核表達載體pET-28a（購自於優寶生物科技有限公司，貨號：VT1207）上。以大腸埃希菌BL21（DE3）（購自於優寶生物科技有限公司，貨號：ST1007）作為原核表達的宿主菌，構建BL21/pET-28a-rLaChIFNα重組菌，將質粒抽提送測序，將重組菌用IPTG誘導其表達長效雞干擾素α，經聚丙烯醯胺凝膠電泳（SDS-PAGE）及蛋白免疫印跡實驗（WesternBlot）鑑定後保存菌種。
重組長效雞干擾素α經純化、除菌、分裝和凍乾製成凍乾粉針劑。加2毫升注射用水後迅速溶解為均勻懸濁液。規格為：干擾素含量≥1000萬IU/瓶，2～8℃可長期保存。使用時輕輕搖勻後翅下肌肉注射，每次注射10萬單位/羽，一個療程3次。在治療已發病雞的同時，應及時隔離未發病雞並給予等量藥物預防。
改善效果
《一種重組長效雞干擾素α的製備方法》與2016年8月之前的技術相比，所制的重組長效雞干擾素α是一類能長期誘導雞細胞產生多種廣譜抗病毒蛋白的細胞因子，半衰期在6天左右，能夠用於禽流感、雞新城疫等病毒性疾病的防治。
附圖說明
圖1為雞干擾素α基因及雞血清白蛋白基因RT-PCR擴增的結果。在圖1中，泳道M：DNA Marker DL 2000，泳道1：雞干擾素α基因RT-PCR擴增產物在502bp左右出現單一條帶；泳道2：雞血清白蛋白基因RT-PCR擴增產物在1848bp左右出現單一條帶；
圖2為雞干擾素α基因與雞血清白蛋白基因連線擴增的結果。在圖2中，泳道M：DNA Marker DL 2000，泳道1：雞干擾素α基因與雞血清白蛋白基因連線擴增產物在2365bp左右出現條帶；雞血清白蛋白擴增產物在1848bp左右出現條帶，雞干擾素α在502bp左右出現條帶，為非特異反應。
圖3為重組質粒pET-28a/rLaChIFN-αPCR及雙酶切結果在圖3中，泳道M：DNA Marker DL 2000，泳道1：pET-28a質粒對照，泳道2：質粒PCR結果，泳道2：重組質粒雙酶切結果；
圖4為IPTG32℃誘導的重組長效雞干擾素α蛋白SDS-PAGE電泳檢測結果。在圖4中，泳道M：蛋白Marker，泳道1：IPTG32℃誘導後空菌菌體，泳道2：重組長效雞干擾素α工程菌誘導5小時後的菌體破碎後沉澱，泳道3：重組長效雞干擾素α工程菌誘導5小時後的菌體破碎後上清，可見重組菌誘導5小時後的菌體破碎後上清和沉澱在105KD處優勢表達條帶。
圖5為重組蛋白WesternBlot鑑定結果。在圖5中，泳道M：蛋白Marker，泳道1：空菌對照，泳道2：重組長效雞干擾素α工程菌誘導破碎後沉澱，泳道3：為重組長效雞干擾素α工程菌誘導破碎後上清。
圖6為重組長效雞干擾素α對VSV致細胞病變的抑制作用。在圖6中，1為VSV病毒對照孔，2為HEp-2細胞對照孔；A3-12為梯度稀釋（從右向左）的人干擾素標準品處理孔；B3-12為梯度稀釋（從右向左）的rLaChIFNα處理孔；
圖7為重組長效雞干擾素α工程菌菌株革蘭染色光鏡圖（1000×）。
圖8為肉雞單次注射rLaChIFNα後rLaChIFNα濃度時間曲線。
技術領域
《一種重組長效雞干擾素α的製備方法》屬於基因重組技術領域，涉及一種重組長效雞干擾素α（RecombinantLong-actingchickeninterferonα，rLaChIFNα）的製備方法。
權利要求
1.《一種重組長效雞干擾素α的製備方法》其特徵在於所述的方法由下列步驟組成：（1）長效雞干擾素α基因的獲取，所述長效雞干擾素α基因的核苷酸序列如SeqIDNO.3所示；（2）所述長效雞干擾素α基因連線至原核表達載體pET-28a上獲得表達載體；（3）所述表達載體轉化大腸桿菌，獲得基因工程菌；（4）所述基因工程菌用IPTG誘導，表達長效雞干擾素α；（5）重組長效雞干擾素α粗製品的製備；（6）重組長效雞干擾素α粗製品的純化；
所述長效雞干擾素α基因的獲取步驟為：利用引物，從雞肝臟組織中提取RNA進行RT-PCR反應，並將擴增出的雞干擾素α基因及雞血清白蛋白基因通過柔性link連線起來；所述雞干擾素α基因的核苷酸序列如SeqIDNO.1所示；所述雞血清白蛋白基因的核苷酸序列如SeqIDNO.2所示；所述雞干擾素α基因的引物序列為：上游：GAATTCCCCACCATGGCTGTGC下游：GGCGGCGGCGGCTCCAGTGCGCGTGTTGCCTGTGAGG上游引物帶有EcoRI酶切位點；下游引物帶有linker；所述雞血清白蛋白基因的引物序列：上游：CCGCCGCCGCCGATGAAGTGGGTAAC下游：CCATGGTTAAGCACCAATTCCTAATGTGGCTCTGCTTTGG上游引物帶有linker；下游引物帶有NcoI酶切位點；所述RT-PCR反應的反應體系為：在25微升的總反應體系中，模板RNA1.5微升，上下游引物各0.5微升，反轉錄酶2.5微升，dNTPMix為10微升，加RNaseFree水至25微升；所述RT-PCR反應的反應條件為：50℃反轉錄30分鐘，95℃預變性4分鐘；94℃變性45秒，58℃退火45秒，72℃延伸1分鐘，循環35次，最後72℃延伸10分鐘；
所述雞干擾素α基因及雞血清白蛋白基因連線PCR反應體系為：在25微升的總反應體系中，雞干擾素模板DNA1微升、雞血清白蛋白模板DNA1微升，雞干擾素上游引物0.5微升，雞血清白蛋白下游引物0.5微升，轉錄酶2.5微升，dNTPMix為10微升，加RNaseFree水至25微升；連線PCR反應條件為：95℃預變性4分鐘；94℃變性45秒，58℃退火45秒，72℃延伸90秒，循環35次，最後72℃延伸10分鐘；所述大腸桿菌為BL21大腸桿菌；所述重組長效雞干擾素α粗製品製備的步驟為：離心收集細菌，加入質量體積比1:1的PBS重懸沉澱，-20℃與室溫反覆凍融沉澱3次，4℃超聲裂解細菌沉澱，超聲功率:400W，工作10s，間隔3S，超聲6分鐘，重複3～4次，4℃離心，12000轉/分鐘離心15分鐘，分別取上清、沉澱，得到粗製蛋白。
2.根據權利要求1所述一種重組長效雞干擾素α的製備方法，其特徵在於：所述重組長效雞干擾素α粗製品純化的步驟為：親和層析、脫鹽、緩衝液置換、離子交換層析和分子篩層析。
3.如權利要求1所述一種重組長效雞干擾素α的製備方法構建的基因工程菌，其特徵在於，所述基因工程菌可以表達長效雞干擾素α。
4.如權利要求1所述一種重組長效雞干擾素α的製備方法製備的重組長效雞干擾素α。
- 實施例1
重組長效雞干擾素α製備工藝流程長效雞干擾素α基因的獲取：
採用TAKARA公司RNA提取試劑盒從雞肝臟組織中提取RNA，並利用引物進行RT-PCR反應；
雞干擾素α基因引物序列：
上游：GAATTCCCCACCATGGCTGTGC
下游：GGCGGCGGCGGCTCCAGTGCGCGTGTTGCCTGTGAGG
上游引物帶有EcoRI酶切位點；下游引物帶有linker雞干擾素α目的基因如SeqIDNO.1所示。
雞血清白蛋白基因引物序列：
上游：CCGCCGCCGCCGATGAAGTGGGTAAC
下游：CCATGGTTAAGCACCAATTCCTAATGTGGCTCTGCTTTGG
上游引物帶有linker；下游引物帶有NcoI酶切位點。
雞血清白蛋白目的基因如SeqIDNO.2所示。
RT-PCR反應體系：在25微升的總反應體系中，模板RNA1.5微升，上下游引物各0.5微升，反轉錄酶2.5微升，dNTPMix為10微升，加RNaseFreeH2O至25微升；RT-PCR反應條件：50℃反轉錄30分鐘，95℃預變性4分鐘；94℃變性45秒，58℃退火45秒，72℃延伸1分鐘，循環35次，最後72度延伸10分鐘，RT-PCR擴增產物經瓊脂糖凝膠電泳在582bp和1848bp左右出現特異條帶，其結果如圖1所示。
連線PCR反應體系：在25微升的總反應體系中，雞干擾素模板DNA1微升、雞血清白蛋白模板DNA1微升，雞干擾素上游引物0.5微升，雞血清白蛋白下游引物0.5微升，轉錄酶2.5微升，dNTPMix為10微升，加RNaseFree水至25微升；PCR反應條件：95℃預變性4分鐘；94℃變性45秒，58℃退火45秒，72℃延伸90秒，循環35次，最後72度延伸10分鐘，RT-PCR擴增產物經瓊脂糖凝膠電泳在2365bp左右出現特異條帶，其結果如圖2所示。所述長效雞干擾素α基因的核苷酸序列如SeqIDNO.3所示。
表達載體、基因工程菌的構建：
選擇目的基因經測序後無誤的連線後PCR的膠回收產物進行雙酶切後與雙酶切後表達載體pET-28a進行連線，並轉化至BL21大腸桿菌，分別塗布於含氨苄青黴素的LB培養基平板培養過夜，取LB平板上生長的菌落經PCR鑑定目的基因，陽性克隆菌質粒行EcoRI和NcoI雙酶切鑑定，鑑定為陽性者表示表達載體構建成功，PCR擴增和雙酶切產物經瓊脂糖凝膠電泳在2365bp處出現單一條帶，其結果如圖3所示。
重組蛋白的表達：挑取pET-28a/rLaChIFNα工程菌於含氨苄青黴素100微克/毫升的LB培養基中37℃搖菌1h復甦工程菌活性，後在LB培養基（含氨苄青黴素100微克/毫升）中放大培養4小時後，測OD值達到1.0時，加入IPTG，32℃誘導表達（終濃度100微克/毫升）5小時，收集細菌，經SDS-PAGE電泳檢測，重組菌誘導5小時後的菌體破碎後上清和沉澱在105KD處可見優勢表達條帶，其結果如圖4所示 重組長效雞干擾素α粗製品的製備：
離心收集細菌，加入質量體積比1:1的PBS重懸沉澱，－20℃與室溫反覆凍融沉澱3次，4℃超聲裂解細菌沉澱，功率：400瓦，工作10秒，間隔3秒，超聲6分鐘，重複3～4次，4℃離心，12000轉/分鐘離心15分鐘，分別取上清、沉澱，得到粗製蛋白；重組長效雞干擾素α粗製品純化：
親和層析：
將粗製蛋白過濾處理後過GST親和層析柱，用Elution buffer（50毫摩爾/升Tris-Cl，40毫摩爾/升還原性谷胱甘肽，pH8.0）梯度洗脫，收集rLaChIFNα峰；脫鹽、緩衝液置換：將第一步純化的rLaChIFNα過脫鹽柱，用緩衝液（50毫摩爾/升Tris-Cl，pH7.0）置換，準備下一步離子交換層析；離子交換層析：分別用Loading buffer（50毫摩爾/升Tris-Cl，pH7.0）平衡好柱體，上樣後用Elution buffer（50毫摩爾/升Tris-Cl，1摩爾/升NaCl，pH7.0)梯度洗脫，收集rLaChIFNα峰；
分子篩層析：離子交換層析收集到的rLaChIFNα過分子篩層析柱，Elution buffer（50毫摩爾/升Na2HPO4，0.15摩爾/升NaCl，pH7.0）收集rLaChIFNα峰；
測定rLaChIFNα效價及比活性，比活性≥1.0×10IU/mg蛋白為合格；
無菌分裝，-80℃保存。
- 實施例2
重組長效雞干擾素α的鑑定
蛋白含量的定量檢測：用Lowry法，以中國食品藥品生物製品檢定院的標準蛋白作標準測定。SDS-PAGE電泳檢測：與空菌相比，重組菌在105KD左右有一條濃染的新增蛋白條帶。WesternBlot結果：以abcam公司鼠抗雞α干擾素（1:5000稀釋）為一抗，以山羊抗小鼠IgG-HRP為二抗（1:10000稀釋）。重組長效雞干擾素α樣品能與抗雞干擾素α單克隆抗體發生特異性反應，105KD左右處出現特異性條帶，如圖5所示。
- 實施例3
重組長效雞干擾素α效價檢測
按照微量細胞病變抑制法，採用VSV/HEp-2系統：在96孔微量細胞培養板上用DMEM營養液培養HEp-2細胞，置5％CO2培養箱37℃條件下培養24小時，加入不同劑量的重組長效雞干擾素α，24小時後吸棄，再分別接種100 TCID 50 VSV病毒。
結果表明獲得的重組長效雞干擾素α對VSV引起HEp-2細胞的病變具有明顯的抑制作用。未經處理的細胞接種病毒後均出現細胞變圓、脫落、崩解等病變。而獲得的重組長效雞干擾素α處理後的細胞接種病毒後，在倒置顯微鏡下連續觀察，細胞形態正常，未出現任何病變，測得效價≥1.0×10IU/毫升，如圖6所示。
- 實施例4
重組長效雞干擾素α在雞體內的半衰期的測定
HPLC-MS/MS法，測定rLaChIFNα的血藥濃度與時間關係，使用WinNonlin軟體處理，計算rLaChIFNα在雞體內的藥代動力學參數。取六隻體重大致相同的肉雞（雌雄各半），頸部皮下注射2毫克/毫升rLaChIFNα2毫升，分別在小時、2小時、4小時、8小時、16小時、26小時、44小時、79小時、144小時、194小時、254小時、324小時翅下採血，置於37℃溫箱靜置30分鐘，取血清，使用HPLC測定rLaChIFNα濃度：
Time（小時） | Concern（納克/毫升） |
|---|---|
0 | 0 |
1 | 6.02±0.12 |
2 | 10.3±0.07 |
4 | 22.65±0.02 |
8 | 59.76±0.08 |
16 | 80.56±0.05 |
26 | 82.22±0.10 |
44 | 68.87±0.03 |
79 | 55.21±0.04 |
144 | 42.32±0.03 |
194 | 28.77±0.11 |
254 | 19.4±0.09 |
324 | 17.87±0.04 |
參數 | 值 |
|---|---|
吸收半衰期T（1/2α） | 6.45±0.53小時 |
消除半衰期T（1/2β） | 144.25±1.61小時 |
達峰時間TMAX | 20.87±2.31小時 |
達峰濃度CMAX | 84.39±0.87納克/毫升 |
結果表明重組長效雞干擾素α有較長的半衰期。經HPLC-MS/MS測定法測定後半衰期能達到144小時左右，較普通干擾素提高約24倍。見圖8。
榮譽表彰
2020年7月17日，《一種重組長效雞干擾素α的製備方法》獲得安徽省第七屆專利獎銀獎。
