《一種輔助鑑定玉米單倍體誘導系的方法及其專用引物》是中國農業大學於2011年10月27日申請的專利，該專利的公布號為CN103088109A，授權公布日為2013年5月8日，發明人是陳紹江、徐小煒、黎亮、董昕。
《一種輔助鑑定玉米單倍體誘導系的方法及其專用引物》公開了一種輔助鑑定玉米單倍體誘導系的方法及其專用引物。該發明提供的用於鑑定玉米單倍體誘導系的引物對，為SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示的引物對。該發明的利用分子標記進行輔助鑑定單倍體誘導系的方法及引物對，可以不通過單株誘導率測驗，在苗期即可淘汰掉大量無誘導率單株，增大單倍體誘導系的選育效率，加速單倍體誘導系的選育進程。在與以往相同選育規模下，可以更加注重對農藝性狀的篩選。
2020年7月14日，《一種輔助鑑定玉米單倍體誘導系的方法及其專用引物》獲得第二十一屆中國專利獎優秀獎。
基本介紹
- 中文名：一種輔助鑑定玉米單倍體誘導系的方法及其專用引物
- 申請人：中國農業大學
- 申請日：2011年10月27日
- 申請號：201110332342X
- 公布日：2013年5月8日
- 公布號：CN103088109A
- 發明人：陳紹江、徐小煒、黎亮、董昕
- 地址：北京市海淀區圓明園西路2號
- Int. Cl.：C12Q1/68(2006.01)I、C12N15/11(2006.01)I
- 代理機構：北京紀凱智慧財產權代理有限公司
- 代理人：關暢
- 類別：發明專利
專利背景,發明內容,專利目的,技術方案,附圖說明,技術領域,權利要求,實施方式,操作內容,實施案例,榮譽表彰,
專利背景
二十世紀以來，以生物誘導為基礎的單倍體育種技術已逐步成為玉米育種中的關鍵技術，與轉基因技術、分子標記輔助選擇並稱為現代玉米育種中得三項核心技術。玉米育種中玉米單倍體產生的主要途徑是誘導系雜交誘導途徑產生母本（雌性）單倍體，簡稱為孤雌生殖單倍體。Coe（Coe E H.A line of maize with high haploid frequency[J].Am Nat，1959，93：381-382）在1959年發現了玉米孤雌生殖誘導系Stock6。由於Stock6缺乏用以鑑別雜交誘導的單倍體穿的遺傳標記基因，無法在生產中直接利用。在此基礎上，人們不斷對其進行改造，如轉入Navajo（ACR-nj）遺傳標記基因，通過籽粒顏色和植株顏色鑑定出單倍體，從而使雜交誘導單倍體進行單倍體育種成為了可能。但是在實踐套用中也發現，Stock6的誘導率也很低（約為3％），並且存在很多嚴重的缺陷，如雄花對溫度敏感，自交結實性差，穗粒腐病嚴重，Navajo遺傳標記較弱。因此，利用Stock6誘導單倍體的關鍵是要在保持其誘導能力的前提下克服上述缺點。國外在這方面起步較早，並已取得了較大進展，選育出了一些優良的誘導系，如法國的WS14（Lashermes P，Beckert M.Genetic control of maternal haploidy in maize（Zea mays L.）and selection of haploid inducing lines[J].Theor Appl Genet，1988，76（3）：405-410）、前蘇聯的KEMS（Shatskaya O A.et al，Mass induction of maternal haploids in corn[J].Maize Genet Coop Newslett，1994，68：51），摩爾多瓦的MHI（Chalyk S T.Creating new haploid-inducing lines of maize[J].Maize Genet Coop Newslett，1999，73：53-54），德國的RWS（F.K.Rober et al.，In vivo haploid induction in maize-Performance of new inducers and significance of doubled haploid lines in hybrid breeding[J].Maydica，2005，50：275-283）等等。這些新選的誘導系不但適應當地的環境，而且其誘導率及遺傳標記也進一步提高，利用價值已經大大超出了Stock6。
誘導系的選育是耗時費力的過程，一個誘導系的選育往往要花費7-10年時間。由於誘導系的選育需要每代單株測驗誘導率，選育規模越大所需的工作量越大。例如某世代測驗規模為400個株系，每個株系有10株，每株測驗3穗測驗種，就將測驗12000個果穗，僅田間種植就將需要5畝試驗地。收穫後，對得到的雜交果穗挑選單倍體，測定單株誘導率。單倍體的篩選在世界範圍內均為手工操作，一個熟練工每日可完成30個果穗的單株誘導率測定工作，那么僅考種一項，就需要10個熟練工連續工作40天。如果縮小育種規模在常規選育條件下往往會丟失掉誘導性狀。由於誘導性狀選育的複雜性，很難在選擇誘導率的同時兼顧農藝性狀等，造成誘導系本身適應性差。我國各生態區域氣候條件複雜，2011年之前的的誘導系很難在中國各地廣泛使用，加之在不適合的氣候條件下，誘導系可能會不散粉、不結實等，造成巨大經濟損失。因此有必要在不同生態區域選育適合當地氣候條件的誘導系，有必要突破常規方法，降低單倍體誘導性狀的選育難度，提高誘導系選育效率，使得誘導系的選育過程中誘導率與農藝性狀能夠被兼顧。
分子標記輔助選擇（MAS）是隨著現代分子生物學技術的迅速發展而產生的新技術，它可以從分子水平上快速準確地分析個體的遺傳組成，從而實現對基因型的直接選擇，進行分子育種。對於誘導率測定這種耗時費力的性狀，可以在研究其遺傳機制的基礎上，開發出與目標性狀緊密相關的分子標記來進行輔助選擇，以增強育種效率。
發明內容
專利目的
《一種輔助鑑定玉米單倍體誘導系的方法及其專用引物》的一個目的是提供一種用於鑑定玉米單倍體誘導系的引物對。
《一種輔助鑑定玉米單倍體誘導系的方法及其專用引物》所提供的用於鑑定玉米單倍體誘導系的引物對，為SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示的引物對。
《一種輔助鑑定玉米單倍體誘導系的方法及其專用引物》的另一個目的是提供第一種輔助鑑定玉米單倍體誘導系的方法。
《一種輔助鑑定玉米單倍體誘導系的方法及其專用引物》的另一個目的是提供第二種輔助鑑定玉米單倍體誘導系的方法。
技術方案
《一種輔助鑑定玉米單倍體誘導系的方法及其專用引物》所提供的輔助鑑定玉米單倍體誘導系的方法，包括如下步驟：以待測玉米的基因組DNA為模板，用SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示引物對進行PCR擴增，得到PCR擴增產物，再檢測PCR擴增產物；若所述PCR擴增產物為204bp的條帶，則確認所述待測玉米為候選單倍體誘導系。上述第一種輔助鑑定玉米單倍體誘導系的方法中，所述待測玉米的基因組DNA為待測玉米籽粒胚乳DNA。
《一種輔助鑑定玉米單倍體誘導系的方法及其專用引物》所提供的第二種輔助鑑定玉米單倍體誘導系的方法，包括如下步驟：以待測玉米的基因組DNA為模板，用SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示引物對進行PCR擴增，得到的PCR擴增產物記作PCR擴增產物I；以已知的玉米單倍體誘導系的基因組DNA為模板，用SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示引物對進行PCR擴增，得到的PCR擴增產物記作PCR擴增產物II；檢測所述PCR擴增產物I與所述PCR擴增產物II是否相同，若相同，則確認所述待測玉米候選為玉米單倍體誘導系。上述第二種輔助鑑定玉米單倍體誘導系的方法中，所述基因組DNA為玉米籽粒胚乳DNA。上述第二種輔助鑑定玉米單倍體誘導系的方法中，所述已知玉米單倍體誘導係為高頻單倍體誘導系CAU5。
《一種輔助鑑定玉米單倍體誘導系的方法及其專用引物》的利用分子標記進行輔助鑑定單倍體誘導系的方法，可以不通過單株誘導率測驗，在苗期即可淘汰掉大量無誘導率單株，增大單倍體誘導系的選育效率，省時省力，加速單倍體誘導系的選育進程。在與以往相同選育規模下，可以更加注重對農藝性狀的篩選。
附圖說明
圖1為以N1680、CAU5、F1及F2群體的基因組DNA為模板，利用引物對SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2進行PCR擴增，得到的PCR擴增產物的帶型。
圖2為以玉米自交系CAU5、CAUHOI、CAU2、UH400、N1680、B73的基因組DNA為模板，利用利用引物對SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2進行PCR擴增，得到的PCR擴增產物的帶型。
技術領域
《一種輔助鑑定玉米單倍體誘導系的方法及其專用引物》涉及一種利用分子標記輔助鑑定玉米單倍體誘導系的方法及其專用引物。
權利要求
1.一種用於鑑定玉米單倍體誘導系的引物對，為SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示的引物對。
2.一種輔助鑑定玉米單倍體誘導系的方法，包括如下步驟：以待測玉米的基因組DNA為模板，用SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示引物對進行PCR擴增，得到PCR擴增產物，再檢測PCR擴增產物；若所述PCR擴增產物為204bp的條帶，則確認所述待測玉米為候選單倍體誘導系。
3.根據權利要求2所述的方法，其特徵在於：所述待測玉米的基因組DNA為待測玉米籽粒胚乳DNA。
4.一種輔助鑑定玉米單倍體誘導系的方法，包括如下步驟：以待測玉米的基因組DNA為模板，用SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示引物對進行PCR擴增，得到的PCR擴增產物記作PCR擴增產物I；以已知的玉米單倍體誘導系的基因組DNA為模板，用SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示引物對進行PCR擴增，得到的PCR擴增產物記作PCR擴增產物II；檢測所述PCR擴增產物I與所述PCR擴增產物II是否相同，若相同，則確認所述待測玉米候選為玉米單倍體誘導系。
5.根據權利要求4所述的方法，其特徵在於：所述基因組DNA為玉米籽粒胚乳DNA。
6.根據權利要求4或5所述的方法，其特徵在於：所述已知玉米單倍體誘導係為高頻單倍體誘導系CAU5。
實施方式
操作內容
1、高油玉米自交系N1680：N1680為高油自交系，平均油份達到8％，雄穗發達，花粉量大，無單倍體誘導率，無R-nj標記，可以從中國農業大學國家玉米改良中心獲得；高油玉米自交系N1680在文獻“陳紹江，姜海鷹，宋同明.玉米顯性高油基因存在的若干證據[J]，中國農業大學學報9（6）7-8”中公開過，公眾可以從中國農業大學獲得。
2、高頻單倍體誘導系CAU2、CAU3、CAU5、CAU079：單倍體誘導系CAU2、CAU3、CAU5、CAU079為中國農業大學選育的二代單倍體誘導系，平均誘導率均達到10％以上，具有R-nj標記，在“陳紹江，黎亮，李浩川.玉米單倍體育種技術[M].中國農業大學出版社，2009.”一書中公開過，公眾可以從中國農業大學獲得。
3、高油單倍體誘導系CAUHOI：CAUHOI為高油單倍體誘導系（Liang Li，Xiaowei Xu，Weiwei Jin，Shaojiang Chen.Morphological and molecular evidences for DNA introgression in haploid induction via a high oil inducer CAUHOI in maize.Planta，2009，230：367-376），誘導率在2％，具有R-nj標記，公眾可以從中國農業大學獲得。
4、高頻單倍體誘導系UH400：UH400單倍體誘導率達到8％左右，在文獻“Prigge V，Sánchez C，Dhillon BS，SchipprackW，Araus JL，M，Melchinger AE.Doubled haploids in tropical maize：I.Effects of inducers and source germplasm on in vivo haploid induction rates.Crop Sci，2011，51：1-9.”中公開過，由德國霍恩海姆大學選育，公眾可以從中國農業大學獲得。
5、高油玉米自交系GY923、BY815在文獻“姜海鷹，陳紹江，高蘭鋒，邢吉敏，宋同明，戴景瑞.高油玉米自交系的雜種優勢群劃分和優勢模式分析[J]，作物學報，2005，361-367.”中公開過，公眾可以從中國農業大學獲得。
6、B73、Mo17、178、黃C為常規自交系，在“曹廣才，徐雨昌.實用玉米自交系[M].氣象出版社，2000.”一書中詳細介紹。公眾可以從中國農業大學獲得。
7、鄭單958可以從北京德農種業購得。
實施案例
實施例1、單倍體誘導性狀QTL qHI-1的發現
利用高油玉米自交系N1680與誘導系CAU5進行雜交和自交，構建了F2群體，再利用SSR標記在誘導系CAU5的第一號染色體上發現了一個控制單倍體誘導能力的主效QTL。在此基礎上，擴大F2群體的規模，利用F2代搜尋交換單株，F2：3鑑定表型的方法，對該QTL進行精細定位，將其定位到一號染色體1.04區域上的分子標記X18與X93之間的800kb範圍內，將其命名為qHI-1，田間試驗證明攜帶該基因的單株誘導率在2％-15％之間，不攜帶該基因的植株沒有單倍體誘導能力或單倍體誘導能力很低（單倍體誘導率均值僅為0.52％）。
實施例2、玉米單倍體誘導性狀QTL qHI-1的套用
一、引物設計及帶型分析
利用實例1獲得的QTL qHI-1所在區域玉米自交系B73的序列，利用Primer Premier 5.0軟體設計得到輔助篩選單倍體誘導性狀的引物，命名為X18，是由SEQ ID NO：1與SEQ ID NO：2組成的一對引物，引物序列如下：
SEQ ID NO：1：CGGTGAAGGCATCAGAAGGG；
SEQ ID NO：2：GGGAGGACGGCAAGCAAGAG。
二、《一種輔助鑑定玉米單倍體誘導系的方法及其專用引物》方法
1、製備F2代植株
以高油玉米自交系N1680做母本，CAU5為父本配置F1。誘導系CAU5為早熟材料，在中國農大北京上莊實驗站，播種至散粉需65天；N1680為中晚熟材料，播種至散粉需75天，為使花期協調，需將N1680提前播種10天。得到的雜交種子為F1代種子，將F1代種子進行播種得到的植株即為F1代植株；將F1代植株自交，得到的種子為F2代種子。
2、玉米單倍體誘導性狀QTL qHI-1的篩選
首先選取F2代種子中有R-nj標記的籽粒，提取籽粒胚乳DNA。提取的方法為：首先用水稍微浸泡一下籽粒，而後切取少許胚乳至96孔PCR板內，隨後向孔內加100微升0.1M的NaOH，99.9℃煮10-12分鐘（PCR儀），而後12℃保存。1000轉離心1分鐘後，加100微升 1×TE 2.0（用HCL調至pH 2.0），混勻後，2000轉離心5分鐘後，上清液即為提取好的胚乳基因組DNA。
利用上述SSR引物進行對胚乳基因組DNA進行PCR擴增。PCR的反應體系為：玉米胚乳基因組DNA 5微升，正向引物0.75微摩爾，反向引物0.75微摩爾，100微摩爾 dNTPs，1.5微升 10×PCR緩衝液，Taq酶1U，用超純水補足15微升。循環擴增程式為：95℃預變性5分鐘，進入循環：94℃變性50秒；58℃復性50秒；72℃延伸50秒；循環32次後在72℃延伸5分鐘，置於4℃下保存。
擴增產物利用聚丙烯醯胺凝膠電泳銀染法顯示，照相，統計帶型。
共選取了1000個有R-nj標記的籽粒進行分子標記檢測，擴增帶型如圖1所示，圖中，1：N1680，2：CAU5，3：F1，4-43：F2群體。共有如下三種帶型：
1）與誘導系CAU5一致的帶型：擴增產物在聚丙烯醯胺凝膠上顯示200bp的條帶，該條帶的理論大小為204bp；
2）與自交系N1680一致的帶型：擴增產物在聚丙烯醯胺凝膠上顯示180bp的條帶，該條帶的理論大小為186bp；
3）雜合帶型：擴增產物在聚丙烯醯胺凝膠上同時顯示180bp與200bp的條帶。
若擴增產物帶型與誘導系CAU5帶型一致，則確認其對應的F2籽粒為單倍體誘導系。
結果，1000個有R-nj標記的籽粒中，擴增產物帶型與誘導系CAU5一致的有115粒；擴增產物帶型與自交系N1680一致的為365粒；擴增產物帶型與F1一致表現為雜合的有520粒。如果擴增產物為與誘導系CAU5一致的帶型或雜合帶型，則認為該模板DNA所對應的F2籽粒具有單倍體誘導性狀QTL qHI-1，這樣總計有635個籽粒符合目標，但是考慮到雜合型籽粒後代仍會分離以及田間工作量，選取了只具有與誘導系CAU5一致的帶型的115個籽粒作為目標籽粒進行田間種植。苗期取植株葉片DNA，利用上述分子標記檢測植株基因型，驗證利用胚乳DNA進行基因型分析的效果。結果顯示：葉片DNA檢測結果與胚乳DNA檢測結果保持一致。對分子標記鑑定為陽性的84個F2植株用傳統方法（田間鑑定）進行鑑定。將此84個F2代單株作為目標單株進行自交，並分別採集F2代單株花粉與5穗鄭單958雜交，從得到的雜交種子挑選單倍體，統計每個F2單株的單倍體誘導率，根據誘導率確定該F2代單株是否具有單倍體誘導性狀。
鑑定雜交種子是否是單倍體方法：1）、胚芽顏色鑑定：採用顏色標記法進行初步鑑定，即依據雜交當代籽粒胚芽的Navajo標記來進行鑑別：糊粉層為紫色、紫色胚芽的雜交當代籽粒為雜合籽粒；糊粉層為紫色、無紫色胚芽的雜交當代籽粒為擬單倍體籽粒。2）、將擬單倍體種植於上莊實驗站，根據植株顏色、株高、育性三個標準進行鑑定：單倍體植株淺綠、株高顯著低於正常二倍體，葉片較窄且上沖，散粉期表現為高度不育或部分可育；如果植株矮小、葉片上沖且在散粉期雄穗不育可判斷為單倍體，植株高大、葉片披散且雄穗育性良好為雜合二倍體。
單倍體誘導率的統計方法如下：
1）、統計同一F2單株誘導的5穗鄭單958雜交種子中，有標記籽粒總量、擬單倍體總量、擬單倍體田間出苗數、田間單倍體數；
2）、擬單倍體誘導率＝擬單倍體籽粒數量/有標記總籽粒數量×100％；
3）、矯正係數＝田間單倍體數/擬單倍體田間出苗數；
4）、單倍體誘導率＝校正係數×擬單倍體誘導率。
結果：分子標記鑑定為陽性的且收集到表型的84個F2植株，單倍體誘導率介於1.7％-15.45％之間，均值為6.24％±2.97％，這些陽性植株都具有單倍體誘導能力，鑑定的假陽性率為0。其中有51個單株的誘導率大於5％，誘導率大於7％的單株有26個。
實施例3、用篩選標記X18進行鑑定
一、材料
玉米自交系N1680、CAU5、CAUHOI、CAU2、CAU3、CAU079、UH400、B73、Mo17、GY923、BY815、178、黃C。其中CAU5、CAUHOI、CAU2、CAU3、CAU079、UH400為單倍體誘導系；N1680、B73、Mo17、GY923、BY815、178、黃C為常規自交系，即非單倍體誘導系。
二、用分子標記進行鑑定
按照實施例2中分子標記進行鑑定方法，用引物對SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2對以上13個自交系進行基因型分析。檢測結果如圖2所示。圖2中，1：N1680，2：CAU5，3：CAUHOI，4：CAU2，5：CAU3，6：CAU079，7：UH400，8：B73，9：Mo17，10：GY923，11：BY815，12：17813：黃C。結果表明引物在7個誘導系中，均可擴增出與CAU5相同的帶型。在7個無誘導率材料中，除自交系Mo17外，其餘均可擴增出與N1680一致的帶型。具體鑑定結果如表1。
三、田間方法鑑定
按照實例2中田間鑑定方法，對以上13個自交系進行單倍體誘導率的測定，單倍體誘導率結果如表1。
表1：13個玉米自交系單倍體誘導率的分析結果
表1：13個玉米自交系單倍體誘導率的分析結果
註：第一列為編號、第二列為玉米自交系、第三列為傳統方法鑑定單倍體誘導率、第四列為分子標記鑑定。
結果表明，引物對SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2在不同誘導系中的擴增產物保持一致；同時與大多數的非誘導系在該區域具有多態性差異。
用直線回歸的方法進行相關性分析。相關性分析結果表明利用引物對SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2得到的擴增產物即分子標記與單倍體誘導性狀存在顯著關係（表2），因此引物對SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2可用於篩選單倍體誘導系。
表2.SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2的PCR產物與單倍體誘導能力的相關性分析
表2
Ratio1＝在誘導系中檢測到CAU5相同帶型的頻率；Ratio 2＝在非誘導系中檢測到CAU5相同帶型的頻率；**表示p＜0.01。
序列表
榮譽表彰
2020年7月14日，《一種輔助鑑定玉米單倍體誘導系的方法及其專用引物》獲得第二十一屆中國專利獎優秀獎。
