《一種用於免疫層析測定的阻斷劑試劑盒及其使用方法》是廣州科方生物技術股份有限公司於2016年10月31日申請的專利，該專利的公布號為CN106645681A，授權公布日為2017年5月10日，發明人是孫子洪、何明深。該發明涉及生物技術領域。
《一種用於免疫層析測定的阻斷劑試劑盒及其使用方法》包括盒體和設定於盒體內的阻斷劑，所述阻斷劑包括生物阻斷劑和化學阻斷劑，所述生物阻斷劑和化學阻斷劑分開設定於所述盒體中。該發明還公開了該阻斷劑試劑盒的使用方法。該發明的用於免疫層析測定的阻斷劑試劑盒，充分發揮了生物阻斷劑和化學阻斷劑在不同濃度的內源干擾因素下的阻斷作用，能有效預防、控制樣本中內源干擾因素對免疫層析檢測的影響，提高免疫層析定量檢測結果的準確性，具有更好的適用性。
2021年11月，《一種用於免疫層析測定的阻斷劑試劑盒及其使用方法》獲得第八屆廣東專利獎優秀獎。
基本介紹
- 中文名：一種用於免疫層析測定的阻斷劑試劑盒及其使用方法
- 申請人：廣州科方生物技術股份有限公司
- 申請日：2016年10月31日
- 申請號：2016109327855
- 公布號：CN106645681A
- 公布日：2017年5月10日
- 發明人：孫子洪、何明深
- 地址：廣東省廣州市高新技術產業開發區科學城開源大道11號C4棟六層
- 分類號：G01N33/531(2006.01)I
- 代理機構：廣州市越秀區哲力專利商標事務所
- 代理人：羅晶
- 類別：發明專利
專利背景,發明內容,專利目的,技術方案,有益效果,權利要求,實施方式,榮譽表彰,
專利背景
隨著社會的進步，醫學的發展，醫院功能任務發生了重大的改變，由過去單純的治療型，轉向集預防、保健、治療和康復等多項功能於一體的綜合型，為社會提供全方位的優質服務。醫院工作也從單一的院內醫療拓展到院外社區，甚至是邊遠山區等更廣範圍。為了更好地實現醫院的職能，由此需要準確，靈敏，便捷的即時檢驗測試（Point of care test，POCT）。
免疫層析法（Immunochromatography）是八十年代初發展起來的一種新型的免疫診斷技術。其檢測原理是藉助毛細作用，樣本在分析膜上沿特定方向流動，通過免疫標記技術，實現對樣本中待測物的標記，並結合在特定檢測線上，實現對標本的快速檢測。免疫層析技術融合了傳統的免疫分析技術、層析技術、單克隆抗體技術和免疫標記技術的優點，不僅具有良好的靈敏度和特異性，而且無需複雜的分離洗滌步驟和昂貴的檢測儀器，操作簡單，廉價易得。因此，近年來，免疫層析技術在即時檢驗方面得到了飛速的發展，並呈現出良好的發展前景。
與傳統的免疫分析技術一樣，免疫層析檢測也易於受到可能存在與測試樣本的各種因素的干擾。而隨著單克隆抗體技術的發展和免疫學檢測技術的發展，免疫層析檢測方法更加靈敏，因此溶血、黃疸和脂血的干擾顯得微乎其微。相對而言，包括嗜異性抗體（HA）、人抗動物抗體（HAAA）、類風濕因子（RF）以及自身抗體等因素的內源干擾在免疫檢驗中帶來的影響越發引人重視。據研究證實，在健康人群中，約有3%-15%的人體含有內源干擾因素。在飼養寵物的人群和接受過抗體治療的人群中，其比例更加高。總而言之，內源干擾是造成醫學免疫檢驗結果不確定性的重要因素之一。研究和發展降低、消除內源干擾的有效手段，是保證醫學免疫檢驗結果可靠性、保障醫患的利益的重要課題。
針對消除免疫診斷中的內源干擾，2016年前市面上已有的商品化阻斷劑主要有IIR、HBR、MAB33等。利用它們對樣本進行預處理，通過阻斷劑與干擾物的結合以達到減少或消除干擾。然而，研究發現，有些情況下，商品化免疫試劑中添加的這些阻斷劑的阻斷效果並不充分，無法完全預防內源因素對檢測結果的干擾。這主要是因為檢測樣本中干擾因素的種類和濃度各不相同，而且這些干擾因素對不同的檢測項目、不同的檢測試劑的影響也不盡相同。
發明內容
專利目的
為了克服2016年10月之前技術的不足，《一種用於免疫層析測定的阻斷劑試劑盒及其使用方法》的目的在於提供一種用於免疫層析的阻斷劑試劑盒，該阻斷劑試劑盒充分發揮了生物阻斷劑和化學阻斷劑在不同濃度的內源干擾因素下的阻斷作用，能有效預防、控制樣本中內源干擾因素對免疫層析檢測的影響，提高免疫層析定量檢測結果的準確性，具有更好的適用性。該發明的另一目的在於提供該阻斷劑試劑盒的使用方法。
技術方案
《一種用於免疫層析測定的阻斷劑試劑盒及其使用方法》所述阻斷劑試劑盒，包括盒體和設定於盒體內的阻斷劑，所述阻斷劑包括生物阻斷劑和化學阻斷劑，所述生物阻斷劑和化學阻斷劑分開設定於所述盒體中。
優選的，所述生物阻斷劑包括如下組分：第一緩衝溶液5-200毫摩爾/升，NaCl 150-1500毫摩爾/升，第一防腐劑0.05-0.1wt%，動物免疫蛋白100-500毫克/毫升，小牛血清5-20vol%。
優選的，所述化學阻斷劑包括如下組分：第二緩衝溶液5-200毫摩爾/升，NaCl 150-1500毫摩爾/升，第二防腐劑0.05-0.1wt%，PEG0.05-10.0wt%，巰基試劑0.01-0.5摩爾/升和蛋白變性劑0.05-1.0wt%，所述PEG的分子量為2000-25000。
優選的，所述動物免疫蛋白為小鼠IgG、小鼠IgM、兔IgG、山羊IgG、牛IgG、馬IgG中的至少一種。優選的，所述水溶性PEG為PEG8000、PEG6000、PEG4000、PEG2000、PEG1500中的至少一種。優選的，所述巰基試劑為β-巰基乙醇或二硫蘇糖醇。
優選的，所述蛋白變性劑為十二烷基硫酸鈉、尿素、鹽酸胍中的至少一種。優選的，所述第一防腐劑和第二防腐劑均為疊氮化鈉和Proclin300中的一種。優選的，所述第一緩衝溶液和第二緩衝溶液為三羥甲基氨基甲烷-鹽酸緩衝溶液（Tris-HCl），磷酸鹽緩衝溶液（PBS）和3-（N-嗎啉基）丙磺酸鹽緩衝溶液（MOPS）中的一種，所述第一緩衝溶液和第二緩衝溶液的pH值均為7.4-7.6。
該發明還公開了用於免疫層析測定的阻斷劑試劑盒的使用方法。使用試劑盒前，先配置好樣本稀釋液和樣本墊處理液，然後按照下述任一方法使用該試劑盒：
1）將化學阻斷劑加入到樣本稀釋液中，而生物阻斷劑加入到樣本墊處理液中；
2）將化學阻斷劑與生物阻斷劑同時加入到樣本稀釋液中；
3）將化學阻斷劑與生物阻斷劑同時加入到樣本墊處理液中；
4）將化學阻斷劑加入到樣本墊處理液中，生物阻斷劑加入到樣本稀釋液中。
該方案中，化學阻斷劑按照0.2-0.5vol%的比例加入到樣本稀釋液或樣本墊處理液中，生物阻斷劑按照0.2-0.5vol%的比例加入到樣本稀釋液或樣本墊處理液中。
優選的，化學阻斷劑按照0.25vol%的比例加入到樣本稀釋液或樣本墊處理液中，生物阻斷劑按照0.5vol%的比例加入到樣本稀釋液或樣本墊處理液中。更優選的，生物阻斷劑按照0.5vol%的比例加入到樣本墊處理液中，化學阻斷劑按照0.25vol%的比例加入到樣本稀釋液中。
有益效果
相比2016年10月之前的技術，《一種用於免疫層析測定的阻斷劑試劑盒及其使用方法》的有益效果在於：
1.該發明的用於免疫層析測定的阻斷劑試劑盒，包括生物阻斷劑和化學阻斷劑兩個部分，兩部分分開有利於高濃度阻斷試劑的長期穩定。使用時，通過把生物阻斷劑和化學阻斷劑按照特定的比例加入樣本稀釋液或樣本墊處理液中使用，能有效預防、控制樣本中內源干擾因素對免疫層析檢測的影響，提高免疫層析定量檢測結果的準確性。
2.該發明的複合阻斷劑中，化學阻斷劑主要針對過高濃度的內源干擾因素，一方面通過沉聚作用將過高濃度的內源干擾因素控制到一定範圍，也就是生物阻斷劑能充分阻斷干擾的範圍內，避免出現由於個別標本中內源干擾因素過高而導致阻斷失效的情況。另一方面，內源干擾因素多為多重特異性抗體，相對於分析用單克隆抗體，其結合能力較弱。基於兩者親和力強弱的差異，通過在化學阻斷劑中加入適量的蛋白變性劑，可以在保證試劑檢測能力的前提下，減小內源干擾因素對免疫層析檢測的影響。
3.該發明的複合阻斷劑中，生物阻斷劑包含了針對嗜異性抗體、抗動物抗體、類風濕因子等干擾的多種動物免疫蛋白物質，對常規含量的內源干擾因素具有良好的阻斷效果，能有效減少由於內源干擾造成免疫層析檢測的假性結果。
4.該發明複合阻斷劑廣泛適用於多種免疫層析檢測試劑，包括肌紅蛋白、肌酸激酶同工酶MB、心肌肌鈣蛋白I、糖化血紅蛋白、降鈣素原、心型脂肪酸結合蛋白等項目的免疫層析檢測試劑。
權利要求
1.一種用於免疫層析測定的阻斷劑試劑盒，包括盒體和設定於盒體內的阻斷劑，其特徵在於，所述阻斷劑包括生物阻斷劑和化學阻斷劑，所述生物阻斷劑和化學阻斷劑分開設定於所述盒體中。
2.如權利要求1所述的用於免疫層析測定的阻斷劑試劑盒，其特徵在於，所述生物阻斷劑包括如下組分：第一緩衝溶液5-200毫摩爾/升，NaCl 150-1500毫摩爾/升，第一防腐劑0.05-0.1wt％，動物免疫蛋白100-500毫克/毫升，小牛血清5-20vol％。
3.如權利要求1所述的用於免疫層析測定的阻斷劑試劑盒，其特徵在於，所述化學阻斷劑包括如下組分：第二緩衝溶液5-200毫摩爾/升，NaCl 150-1500毫摩爾/升，第二防腐劑0.05-0.1wt％，PEG 0.05-10.0wt％，巰基試劑0.01-0.5摩爾/升和蛋白變性劑0.05-1.0wt％，所述PEG的分子量為2000-25000。
4.如權利要求2所述的用於免疫層析測定的阻斷劑試劑盒，其特徵在於，所述動物免疫蛋白為小鼠IgG、小鼠IgM、兔IgG、山羊IgG、牛IgG、馬IgG中的至少一種；所述第一防腐劑為疊氮化鈉或Proclin 300；所述第一緩衝溶液為三羥甲基氨基甲烷-鹽酸緩衝溶液，磷酸鹽緩衝溶液和3-（N-嗎啉基）丙磺酸鹽緩衝溶液中的一種。
5.如權利要求3所述的用於免疫層析測定的阻斷劑試劑盒，其特徵在於，所述PEG為PEG8000、PEG6000、PEG4000、PEG2000、PEG1500中的至少一種；所述巰基試劑為β-巰基乙醇或二硫蘇糖醇；所述蛋白變性劑為十二烷基硫酸鈉、尿素、鹽酸胍中的至少一種。
6.如權利要求3所述的用於免疫層析測定的阻斷劑試劑盒，其特徵在於，所述第二防腐劑為疊氮化鈉或Proclin 300；所述第二緩衝溶液為三羥甲基氨基甲烷-鹽酸緩衝溶液，磷酸鹽緩衝溶液和3-（N-嗎啉基）丙磺酸鹽緩衝溶液中的一種。
7.如權利要求1-6任一項所述的用於免疫層析測定的阻斷劑試劑盒的使用方法，其特徵在於，選自下述方法中的一種；
方法一：將化學阻斷劑加入到樣本稀釋液中，生物阻斷劑加入到樣本墊處理液中；
方法二：將化學阻斷劑與生物阻斷劑同時加入到樣本稀釋液中；
方法三：將化學阻斷劑與生物阻斷劑同時加入到樣本墊處理液中；
方法四：將化學阻斷劑加入到樣本墊處理液中，生物阻斷劑加入到樣本稀釋液中。
8.如權利要求7所述的用於免疫層析測定的阻斷劑試劑盒的使用方法，其特徵在於，化學阻斷劑按照0.2-0.5vol％的比例加入到樣本稀釋液或樣本墊處理液中，生物阻斷劑按照0.2-0.5vol％的比例加入到樣本稀釋液或樣本墊處理液中。
9.如權利要求8所述的用於免疫層析測定的阻斷劑試劑盒的使用方法，其特徵在於，化學阻斷劑按照0.25vol％的比例加入到樣本稀釋液或樣本墊處理液中，生物阻斷劑按照0.5vol％的比例加入到樣本稀釋液或樣本墊處理液中。
10.如權利要求9所述的用於免疫層析測定的阻斷劑試劑盒的使用方法，其特徵在於，生物阻斷劑按照0.5vol％的比例加入到樣本墊處理液中，化學阻斷劑按照0.25vol％的比例加入到樣本稀釋液中。
實施方式
以下實施方式中，所述小牛血清購自gibco有限公司。
- 實施例1-4
一種用於免疫層析測定的阻斷劑試劑盒，包括盒體和設定於盒體內的阻斷劑，所述阻斷劑包括生物阻斷劑和化學阻斷劑，所述生物阻斷劑和化學阻斷劑分開設定於所述盒體中。其中生物阻斷劑和化學阻斷劑中各成分的含量如表1所示。
組分 | 實施例1 | 實施例2 | 實施例3 | 實施例4 | |
生物阻斷劑 | 鼠 IgG （毫克/毫升） | 100 | 150 | 300 | 150 |
鼠 IgM （毫克/毫升） | 4 | 5 | 6 | 5 | |
免 IgG （毫克/毫升） | 4 | 4 | 4 | 4 | |
羊 IgG （毫克/毫升） | 4 | 4 | 4 | 4 | |
牛 IgG （毫克/毫升） | 4 | 4 | 2 | 4 | |
小牛血清 （vol.%） | 5 | 10 | 15 | 10 | |
PBS（毫摩爾/升） | 20 | 20 | 20 | 20 | |
NaCl（毫摩爾/升） | 300 | 300 | 300 | 300 | |
Proclin 300（wt%） | 0.05 | 0.05 | 0.05 | 0.05 | |
化學阻斷劑 | PEG 6000 （wt%） | 5 | 5 | 3 | 0 |
二硫蘇糖醇（摩爾/升） | 0.2 | 0.1 | 0.05 | 0 | |
尿素（wt%） | 0.05 | 0.05 | 0.05 | 0 | |
PBS（毫摩爾/升） | 20 | 20 | 20 | 20 | |
NaCl（毫摩爾/升） | 300 | 300 | 300 | 300 | |
Proclin 300（wt%） | 0.05 | 0.05 | 0.05 | 0.05 | |
- 實施例5-7
一種用於免疫層析測定的阻斷劑試劑盒，一種用於免疫層析測定的阻斷劑試劑盒，包括盒體和設定於盒體內的阻斷劑，所述阻斷劑包括生物阻斷劑和化學阻斷劑，所述生物阻斷劑和化學阻斷劑分開設定於所述盒體中。其中生物阻斷劑和化學阻斷劑中各成分的含量如表2所示。
組分 | 實施例5 | 實施例6 | 實施例7 | |
生物阻斷劑 | 鼠 IgG （毫克/毫升） | 150 | 150 | 150 |
鼠 IgM （毫克/毫升） | 5 | 5 | 5 | |
兔 IgG （毫克/毫升） | 4 | 4 | 4 | |
羊 IgG （毫克/毫升） | 4 | 4 | 4 | |
牛 IgG （毫克/毫升） | 4 | 4 | 4 | |
小牛血清（vol.%） | 10 | 10 | 10 | |
PBS（毫摩爾/升） | 20 | 20 | 20 | |
NaCI（毫摩爾/升） | 300 | 300 | 300 | |
Proclin 300（wt%） | 0.05 | 0.05 | 0.05 | |
化學阻斷劑 | PEG 6000 （wt% ） | 3 | 3 | 2 |
二硫蘇糖醇（摩爾/升） | 0.02 | 0.02 | 0.01 | |
尿素（wt%） | 0.05 | 0.05 | 0.05 | |
PBS（毫摩爾/升） | 20 | 20 | 20 | |
NaCI（毫摩爾/升） | 300 | 300 | 300 | |
Proclin 300（wt%） | 0.05 | 0.05 | 0.05 | |
實驗例1：用於心肌肌鈣蛋白I（cTnI）的螢光免疫層析定量測定
選取8例已證實存在明顯內源干擾的人血清標本（實驗樣本，標本號1-8）以及2例已證實無明顯內源干擾的人血清樣本（對照樣本，標本號9-10）作為研究對象，按照“快速檢測禽流感病毒及血清抗體的膠體金免疫層析法的建立”（馮娟，揚州大學，2006）中記載的方法製備樣本墊處理液和樣本稀釋液，然後取實施例1-4配製的複合阻斷劑，將生物阻斷劑以0.5vol%的比例加入到樣本墊處理液中，化學阻斷劑以0.5vol%的比例加入到樣本稀釋液中，再按照YY/T1221-2013（心肌肌鈣蛋白I診斷試劑）中規定的方法，對樣本稀釋液進行免疫層析測定，結果如表3所示：
cTnl螢光免疫層析檢測結果（微克/毫升） | |||||
標本號 | 實施例1 | 實施例2 | 實施例3 | 實施例4 | 對照組 |
1 | 1.21 | 1.26 | 0.98 | 0.99 | 0.25 |
2 | 3.12 | 3.45 | 3.31 | 1.35 | <0.03 |
3 | 0.88 | 0.75 | 0.73 | 0.69 | 0.11 |
4 | 0.63 | 0.65 | 0.58 | 0.64 | 0.22 |
5 | 0.21 | 0.12 | <0.03 | 0.24 | 0.89 |
6 | 0.51 | 0.52 | 0.43 | 0.55 | 5.24 |
7 | 0.21 | <0.03 | <0.03 | 3.77 | 20.03 |
8 | 0.33 | 0.26 | 0.28 | 030 | 3.17 |
9 | 0.13 | 0.11 | <0.03 | 0.13 | 0.15 |
10 | 0.71 | 0.74 | 0.68 | 0.79 | 0.77 |
從表3可見，該發明複合阻斷劑能有效減少或排除內源干擾對cTnI螢光免疫層析檢測的不良影響，預防假陽性和假陰性檢測結果的出現，保證了檢測結果的準確性。通過對比上述方案的測試結果發現，雖然在一定範圍內，提高阻斷蛋白（即該發明中的動物免疫蛋白）的加入量有利於增強檢測體系的抗內源干擾能力，但加入過多的阻斷蛋白，即該發明的複合阻斷劑中，生物阻斷劑在cTnI檢測體系中加入量過大，會影響檢測過程中測試抗體與抗原的結合，尤其是對於低值標本的檢測。由此可見，該發明中生物阻斷劑和化學阻斷劑的過量或不足都將影響複合阻斷劑在免疫層析檢測中的使用效果。
此外，通過比對分析實施例2與實施例4中cTnI螢光免疫層析檢測結果，可見化學阻斷劑的加入能有效預防由於測試標本內含有過高的內源干擾因素而導致阻斷失效的情況，有效消除檢測的假性結果。
實驗例2：用於肌紅蛋白（MYO）的螢光免疫層析定量測定
選取8例已證實存在明顯內源干擾的人血清標本（實驗樣本，標本號1-8）以及2例已證實無明顯內源干擾的人血清樣本（對照樣本，標本號9-10）作為研究對象，按照“快速檢測禽流感病毒及血清抗體的膠體金免疫層析法的建立”（馮娟，揚州大學碩士學位論文，2006）中記載的方法製備樣本墊處理液和樣本稀釋液；然後取實施例5-7的複合阻斷劑，將實施例5的生物阻斷劑和化學阻斷劑按照0.25vol%的比例加入到樣本稀釋液中，將實施例6的生物阻斷劑按照0.5vol%的比例加入到樣品墊處理液中，化學阻斷劑按照0.25vol%的比例加入到樣本稀釋液中，實施例7的生物阻斷劑和化學阻斷劑按照0.5vol%的比例加入到樣品墊處理液中；再按照“全血肌紅蛋白快速免疫層析分析”（劉宏偉，張彬，《標記免疫分析與臨床》，2001）中規定的方法，對樣本稀釋液進行免疫層析測定，結果如表4所示：
標本號 | 實施例5 | 實施例6 | 實施例7 | 對照組 |
1 | 0.36 | 0.24 | 0.54 | 23.34 |
2 | 0.60 | 0.55 | 0.97 | 6.46 |
3 | 0.06 | <0.03 | 0.27 | 3.21 |
4 | 0.24 | 0.21 | 0.26 | 1.57 |
5 | 5.11 | 5.64 | 0.78 | <0.03 |
6 | 2.98 | 3.14 | 2.56 | 0.17 |
7 | 0.39 | 0.48 | 031 | 0.12 |
8 | 1.31 | 1.52 | 0.87 | 0.37 |
9 | 0.12 | 0.11 | 0.06 | 0.17 |
10 | 3.01 | 3.10 | 2.78 | 3.23 |
根據表4的結果，該發明的複合阻斷劑按照上述實施例5-7添加到MYO螢光免疫層析檢測試劑中，均能有效減少或消除內源干擾對檢測的影響。其中，分別把生物阻斷劑和化學阻斷劑添加到樣品墊處理液和樣本稀釋液能達到最佳效果。由此可見，該發明的複合阻斷劑能良好地配合不同免疫層析試劑的特點與需求，在各種免疫層析檢測試劑中具有良好的適用性，這對螢光免疫層析試劑在POCT行業中的推廣具有非常重要的幫助。
榮譽表彰
2021年11月，《一種用於免疫層析測定的阻斷劑試劑盒及其使用方法》獲得第八屆廣東專利獎優秀獎。
