一種氧化型輔酶I的製備方法

《一種氧化型輔酶I的製備方法》是合肥平光製藥有限公司於2015年7月16日申請的發明專利，該專利申請號為2015104236677，公布號為CN105131065A，專利公布日為2015年12月09日，發明人是王康林、楊楊、金永紅。

《一種氧化型輔酶I的製備方法》公開了一種氧化型輔酶I的製備方法，包括如下步驟：破碎酵母細胞和提取NAD；其中，破碎酵母細胞的具體步驟為：將酵母加入鹽酸中浸泡後，加熱、保溫、加冰塊冷卻至室溫，離心得到清液A；攪拌12-16小時，攪拌過程中加入717樹脂，攪拌結束後過濾得到清液B；提取NAD包括如下步驟：酸化，交換，洗脫，去鹽，分離，洗脫和收集。該發明能大大增加酵母細胞的破碎率，原料廉價易得，設備簡單，操作方便，適合工業化生產。

2021年8月16日，《一種氧化型輔酶I的製備方法》獲得安徽省第八屆專利獎優秀獎。

基本介紹

• 中文名：一種氧化型輔酶I的製備方法
• 公布號：CN105131065A
• 公布日：2015年12月09日
• 申請號： 2015104236677
• 申請日：2015年7月16日
• 申請人：合肥平光製藥有限公司
• 地址：安徽省合肥市雙鳳開發區淮南路與東方大道交叉口東北側
• 發明人：王康林、楊楊、金永紅
• Int.Cl.：C07H19/207(2006.01)I、C07H1/08(2006.01)I
• 類別：發明專利
• 專利代理機構：合肥市長遠專利代理事務所
• 代理人：程篤慶; 黃樂瑜

專利背景

輔酶I（NAD），化學名為煙醯胺腺嘌呤二核甘酸或二磷酸煙苷，在哺乳動物體記憶體在氧化型（NAD+）和還原型（NADH）兩種狀態，是人體氧化還原反應中重要的輔酶。參與各類細胞功能的新陳代謝，對機體免疫能力有重要作用。在健康狀態下，人體內輔酶I濃度穩定，維持各項細胞正常功能。體內的輔酶I濃度決定了細胞衰老的過程和程度，濃度下降會加速細胞衰老的過程。輔酶I主要存在於酵母細胞線粒體中，屬於胞內酶，且酵母細胞壁厚100-300納米,細胞壁由外及內分別有甘露聚糖層，蛋白質，葡聚糖層組成，其中占30-40％的葡聚糖是不溶性聚糖，構成細胞剛性骨架，保持細胞堅韌性和形態。胞內物質難以釋放出胞外。想要獲得高產量的NAD+，必須充分提高細胞破碎率，從而使得產物能夠釋放到細胞外，為後期提取創造條件。

截至2015年7月，經常使用的破壁方法有溫差法和高壓均漿法，溫差法（熱處理法）主要通過水結冰與加熱熔化產生的力以及溫度突然變化，破壞細胞組織結構，該方法效果不理想；高壓勻漿法需要高壓均質機及大容量高速離心機，其破碎原理為細胞在一系列過程中經歷了高速造成的剪下、碰撞以及由高壓到常壓的變化從而造成細胞的破碎，該方法生產成本高，效率低，不適合工業化大生產。由上可知，兩種方法均無法滿足工業化大生產需要。

發明內容

專利目的

基於背景技術存在的技術問題，《一種氧化型輔酶I的製備方法》提出了一種氧化型輔酶I的製備方法，該發明能大大增加酵母細胞的破碎率，原料廉價易得，設備簡單，操作方便，適合工業化生產。

發明內容

技術方案

《一種氧化型輔酶I的製備方法》提出的一種氧化型輔酶I的製備方法，包括如下步驟：破碎酵母細胞和提取NAD+；其中，破碎酵母細胞的具體步驟為：將酵母細胞加入濃度為0.01-0.12摩爾/升的鹽酸中浸泡0.5-2.5小時後，加熱至85-100℃，保溫3-8分鐘，加冰塊冷卻至室溫，離心得到清液A；攪拌12-16小時，攪拌過程中加入717#樹脂，攪拌結束後過濾得到清液B，其中酵母細胞和鹽酸重量體積比克/毫升）為15-25:80-400，酵母細胞和717#樹脂的重量比為15-25:45-90。優選地，破碎酵母細胞的具體步驟為：將酵母細胞加入濃度為0.06-0.11摩爾/升的鹽酸中浸泡0.7-2小時後，加熱至90-98℃，保溫3-5分鐘，加冰塊以10-15℃/分鐘的速度冷卻至室溫，以4000-6000轉的速度進行離心10-20分鐘得到清液A；攪拌13-15小時，攪拌過程中加入717#樹脂，攪拌結束後過濾得到清液B，其中酵母細胞和鹽酸重量體積比克/毫升）為18-22:100-300，酵母細胞和717#樹脂的重量比為18-22:55-70。優選地，破碎酵母細胞的具體步驟為：將酵母細胞加入濃度為0.1摩爾/升的鹽酸中浸泡1小時後，加熱至95℃，保溫4分鐘，加冰塊以13℃/分鐘的速度冷卻至室溫，5000轉的速度進行離心15分鐘得到清液A；攪拌14小時，攪拌過程中加入717#樹脂，攪拌結束後過濾得到清液B，其中酵母細胞和鹽酸重量體積比克/毫升）為20:120，酵母細胞和717#樹脂的重量比為20:60。優選地，提取NAD+包括如下步驟：酸化，交換，洗脫，去鹽，分離，洗脫和收集。

優選地，提取NAD+的具體步驟如下：S1、酸化：向清液B中加入濃度為5-7摩爾/升的鹽酸調節pH為1.95-2.05得到溶液C；S2、交換：將S1中得到的溶液C以15-20毫升/分鐘的速度上122#柱，上柱結束後，用蒸餾水以15-25毫升/分鐘的速度洗滌，其中，溶液C與蒸餾水的體積比為1:2-3；S3、洗脫：調節液面距122#柱上層樹脂層4-5厘米，用濃度為0.3-0.5摩爾/升的氨水以5-7毫升/分鐘的速度洗脫，當洗脫液pH＝7-8時，開始收集洗脫液D，其中溶液C的體積與氨水的總體積的比為1:2-3；S4、去鹽：向S3中得到的洗脫液D中加入732#樹脂，邊加邊攪拌，至pH為4.95-5.05，過濾得濾液，用蒸餾水洗滌樹脂得洗液，合併濾液和洗液得到溶液E；S5、分離：用氨水調節S4中得到溶液E至pH為6.5-7.5，室溫放置7-8天后，以3.5-5毫升/分鐘的速度上717#樹脂柱，上柱結束後，用40-60毫升蒸餾水以5-7毫升/分鐘的速度洗滌；S6、洗脫：取濃度為0.08-0.12摩爾/升氯化鉀溶液50-70毫升，以3.5-5毫升/分鐘的速度洗脫，收集洗脫液，洗脫液以3.5-5毫升/分鐘的速度上769型炭柱，用20-40毫升蒸餾水以5-7毫升/分鐘的速度洗滌後，用混合溶劑以0.5-1毫升/分鐘的速度洗脫NAD+，其中，混合溶劑由醋酸乙酯、丙酮、水和氨水組成；S7、收集：收集洗脫液，用5.7-6.3摩爾/升硝酸調節pH至2-3，立即加入以洗脫液體積份為基準的1-4倍的冷丙酮靜置30-50分鐘，去上清液，以2000-4000轉的速度，離心2-5分鐘，去上清液，乾燥沉澱得到NAD+，其中冷丙酮的溫度為-5至-15℃。

優選地，S2中，將S1中得到的溶液C以18毫升/分鐘的速度上122#柱，上柱結束後，用蒸餾水以20毫升/分鐘的速度洗滌，至流出液呈透明淡黃色。優選地，S6中，混合溶劑中醋酸乙酯、丙酮、水和氨水的體積比為100:400:500：2。優選地，S7中，分步收集洗脫液，用丙酮測試洗脫液有無沉澱，合併有沉澱的洗脫液，用5.7-6.3摩爾/升硝酸調節pH至2-3，立即加入以有沉澱的洗脫液體積份為基準的2-3倍的冷丙酮靜置35-45分鐘，去上清液，以2500-3500轉的速度，離心3-4分鐘，去上清液，乾燥得到NAD+，其中冷丙酮的溫度為-10至-15℃。上述717#樹脂為強鹼性苯乙烯系陰離子交換樹脂。上述“上柱”是本專業常用術語，意思為將溶液以一定流速從柱子上端倒入柱子中。上述S2中122#柱為弱酸性酚醛系陽離子交換樹脂。上述S4中732#樹脂為強酸性苯乙烯系陽離子交換樹脂。上述S6中769型炭柱為活性炭柱。

發明內容

改善效果

《一種氧化型輔酶I的製備方法》採用酸-熱處理的方法來破碎酵母細胞，條件較溫和，對內容物分子破壞性小，且酸性條件有利於輔酶I的穩定，並可以大大增加酵母細胞的破碎率；使用的酵母、鹽酸均廉價易得，可以降低生產成本；該發明設備簡單、操作方便，適合工業化生產，而且相對於化學合成的方法，更加安全，產品中幾乎無毒害化學物質殘留。

技術領域

《一種氧化型輔酶I的製備方法》涉及輔酶I製備技術領域，尤其涉及一種氧化型輔酶I的製備方法。

權利要求

1.《一種氧化型輔酶I的製備方法》特徵在於，包括如下步驟：破碎酵母 細胞和提取NAD；

其中，破碎酵母細胞的具體步驟為：將酵母細胞加入濃度為0.01-0.12摩爾/升 的鹽酸中浸泡0.5-2.5小時後，加熱至85-100℃，保溫3-8分鐘，加冰塊冷卻至室 溫，離心得到清液A；攪拌12-16小時，攪拌過程中加入717樹脂，攪拌結束後過 濾得到清液B，其中酵母細胞和鹽酸重量體積比克/毫升）為15-25:80-400，酵 母細胞和717樹脂的重量比為15-25:45-90。

2.根據權利要求1所述氧化型輔酶I的製備方法，其特徵在於，破碎酵母 細胞的具體步驟為：將酵母細胞加入濃度為0.06-0.11摩爾/升的鹽酸中浸泡 0.7-2小時後，加熱至90-98℃，保溫3-5分鐘，加冰塊以10-15℃/分鐘的速度冷卻 至室溫，以4000-6000轉的速度進行離心10-20分鐘得到清液A；攪拌13-15小時， 攪拌過程中加入717樹脂，攪拌結束後過濾得到清液B，其中酵母細胞和鹽酸 重量體積比克/毫升）為18-22:100-300，酵母細胞和717樹脂的重量比為18-22:55-70。

3.根據權利要求1或2項所述氧化型輔酶I的製備方法，其特徵在於，提 取NAD包括如下步驟：酸化，交換，洗脫，去鹽，分離，洗脫和收集。

4.根據權利要求1-3任一項所述氧化型輔酶I的製備方法，其特徵在於， 提取NAD的具體步驟如下：S1、酸化：向清液B中加入濃度為5-7摩爾/升的鹽酸調節pH為1.95-2.05 得到溶液C；S2、交換：將S1中得到的溶液C以15-20毫升/分鐘的速度上122柱，上柱結 束後，用蒸餾水以15-25毫升/分鐘的速度洗滌，其中，溶液C與蒸餾水的體積比 為1:2-3；S3、洗脫：調節液面距122柱上層樹脂層4-5厘米，用濃度為0.3-0.5摩爾/升 的氨水以5-7毫升/分鐘的速度洗脫，當洗脫液pH＝7-8時，開始收集洗脫液D，其 中溶液C的體積與氨水的總體積的比為1:2-3；S4、去鹽：向S3中得到的洗脫液D中加入732樹脂，邊加邊攪拌，至pH 為4.95-5.05，過濾得濾液，用蒸餾水洗滌樹脂得洗液，合併濾液和洗液得到 溶液E；S5、分離：用氨水調節S4中得到溶液E至pH為6.5-7.5，室溫放置7-8 天后，以3.5-5毫升/分鐘的速度上717樹脂柱，上柱結束後，用40-60毫升蒸餾水 以5-7毫升/分鐘的速度洗滌；S6、洗脫：取濃度為0.08-0.12摩爾/升氯化鉀溶液50-70毫升，以3.5-5毫升/分鐘 的速度洗脫，收集洗脫液，洗脫液以3.5-5毫升/分鐘的速度上769型炭柱，用 20-40毫升蒸餾水以5-7毫升/分鐘的速度洗滌後，用混合溶劑以0.5-1毫升/分鐘的速 度洗脫NAD，其中，混合溶劑由醋酸乙酯、丙酮、水和氨水組成；S7、收集：收集洗脫液，用5.7-6.3摩爾/升硝酸調節pH至2-3，立即加入 以洗脫液體積份為基準的1-4倍的冷丙酮靜置30-50分鐘，去上清液，以 2000-4000轉的速度，離心2-5分鐘，去上清液，乾燥沉澱得到NAD，其中冷丙 酮的溫度為-5至-15℃。

5.根據權利要求3或4項所述氧化型輔酶I的製備方法，其特徵在於，S2 中，將S1中得到的溶液C以18毫升/分鐘的速度上122柱，上柱結束後，用蒸餾 水以20毫升/分鐘的速度洗滌，至流出液呈透明淡黃色。

6.根據權利要求3或4項所述氧化型輔酶I的製備方法，其特徵在於，S6 中，混合溶劑中醋酸乙酯、丙酮、水和氨水的體積比為100:400:500:2。

7.根據權利要求3或4項所述氧化型輔酶I的製備方法，其特徵在於，S7 中，分步收集洗脫液，用丙酮測試洗脫液有無沉澱，合併有沉澱的洗脫液，用 5.7-6.3摩爾/升硝酸調節pH至2-3，立即加入以有沉澱的洗脫液體積份為基準的 2-3倍的冷丙酮靜置35-45分鐘，去上清液，以2500-3500轉的速度，離心3-4分鐘， 去上清液，乾燥得到NAD，其中冷丙酮的溫度為-10至-15℃。

實施方式

• 實施例1

《一種氧化型輔酶I的製備方法》包括如下步驟：破碎酵母細胞和提取NAD+；其中，破碎酵母細胞的具體步驟為：將酵母細胞加入濃度為0.01摩爾/升的鹽酸中浸泡2.5小時後，加熱至85℃，保溫8分鐘，加冰塊以10℃/分鐘的速度冷卻至室溫，以4000轉的速度進行離心20分鐘得到清液A；攪拌16小時，攪拌過程中加入717#樹脂，攪拌結束後過濾得到清液B，其中酵母細胞和鹽酸重量體積比克/毫升）為15:400，酵母細胞和717#樹脂的重量比為15:45；其中，提取NAD+的具體步驟如下：S1、酸化：向清液B中加入濃度為5摩爾/升的鹽酸調節pH為2.05得到溶液C；S2、交換：將S1中得到的溶液C以15毫升/分鐘的速度上122#柱，上柱結束後，用蒸餾水以25毫升/分鐘的速度洗滌，其中，溶液C與蒸餾水的體積比為1:2；S3、洗脫：調節液面距122#柱上層樹脂層4厘米，用濃度為0.5摩爾/升的氨水以5毫升/分鐘的速度洗脫，當洗脫液pH＝8時，開始收集洗脫液D，其中溶液C的體積與氨水的總體積的比為1:2；S4、去鹽：向S3中得到的洗脫液D中加入732#樹脂，邊加邊攪拌，至pH為5.05，過濾得濾液，用蒸餾水洗滌樹脂得洗液，合併濾液和洗液得到溶液E；S5、分離：用氨水調節S4中得到溶液E至pH為6.5，室溫放置8天后，以3.5毫升/分鐘的速度上717#樹脂柱，上柱結束後，用60毫升蒸餾水以5毫升/分鐘的速度洗滌；S6、洗脫：取濃度為0.08摩爾/升氯化鉀溶液70毫升，以3.5毫升/分鐘的速度洗脫，收集洗脫液，洗脫液以5毫升/分鐘的速度上769型炭柱，用20毫升蒸餾水以7毫升/分鐘的速度洗滌後，用混合溶劑以0.5毫升/分鐘的速度洗脫NAD+，其中，混合溶劑由醋酸乙酯、丙酮、水和氨水組成，混合溶劑中醋酸乙酯、丙酮、水和氨水的體積比為100:400:500:2；S7、收集：分步收集洗脫液，用丙酮測試洗脫液有無沉澱，合併有沉澱的洗脫液，用5.7摩爾/升硝酸調節pH至3，立即加入以有沉澱的洗脫液體積份為基準的1倍的冷丙酮靜置50分鐘，去上清液，以2000轉的速度，離心5分鐘，去上清液，乾燥沉澱得到NAD+，其中冷丙酮的溫度為-5℃。

• 實施例2

《一種氧化型輔酶I的製備方法》包括如下步驟：破碎酵母細胞和提取NAD+；其中，破碎酵母細胞的具體步驟為：將酵母細胞加入濃度為0.12摩爾/升的鹽酸中浸泡0.5小時後，加熱至100℃，保溫3分鐘，加冰塊以15℃/分鐘的速度冷卻至室溫，以6000轉的速度進行離心10分鐘得到清液A；攪拌12小時，攪拌過程中加入717#樹脂，攪拌結束後過濾得到清液B，其中酵母細胞和鹽酸重量體積比克/毫升）為25:80，酵母細胞和717#樹脂的重量比為25:90；其中，提取NAD+的具體步驟如下：S1、酸化：向清液B中加入濃度為7摩爾/升的鹽酸調節pH為1.95得到溶液C；S2、交換：將S1中得到的溶液C以20毫升/分鐘的速度上122#柱，上柱結束後，用蒸餾水以15毫升/分鐘的速度洗滌，其中，溶液C與蒸餾水的體積比為1:3；S3、洗脫：調節液面距122#柱上層樹脂層5厘米，用濃度為0.3摩爾/升的氨水以7毫升/分鐘的速度洗脫，當洗脫液pH＝7時，開始收集洗脫液D，其中溶液C的體積與氨水的總體積的比為1:3；S4、去鹽：向S3中得到的洗脫液D中加入732#樹脂，邊加邊攪拌，至pH為4.95，過濾得濾液，用蒸餾水洗滌樹脂得洗液，合併濾液和洗液得到溶液E；S5、分離：用氨水調節S4中得到溶液E至pH為7.5，室溫放置7天后，以5毫升/分鐘的速度上717#樹脂柱，上柱結束後，用40毫升蒸餾水以7毫升/分鐘的速度洗滌；S6、洗脫：取濃度為0.12摩爾/升氯化鉀溶液50毫升，以5毫升/分鐘的速度洗脫，收集洗脫液，洗脫液以3.5毫升/分鐘的速度上769型炭柱，用40毫升蒸餾水以5毫升/分鐘的速度洗滌後，用混合溶劑以1毫升/分鐘的速度洗脫NAD+，其中，混合溶劑由醋酸乙酯、丙酮、水和氨水組成，混合溶劑中醋酸乙酯、丙酮、水和氨水的體積比為100:400:500:2；S7、收集：分步收集洗脫液，用丙酮測試洗脫液有無沉澱，合併有沉澱的洗脫液，用6.3摩爾/升硝酸調節pH至2，立即加入以有沉澱的洗脫液體積份為基準的4倍的冷丙酮靜置30分鐘，去上清液，以4000轉的速度，離心2分鐘，去上清液，乾燥沉澱得到NAD+，其中冷丙酮的溫度為-15℃。

• 實施例3

《一種氧化型輔酶I的製備方法》包括如下步驟：破碎酵母細胞和提取NAD+；其中，破碎酵母細胞的具體步驟為：將酵母細胞加入濃度為0.11摩爾/升的鹽酸中浸泡0.7小時後，加熱至98℃，保溫7分鐘，加冰塊以12℃/分鐘的速度冷卻至室溫，以5500轉的速度進行離心18分鐘得到清液A；攪拌13小時，攪拌過程中加入717#樹脂，攪拌結束後過濾得到清液B，其中酵母細胞和鹽酸重量體積比克/毫升）為22:100，酵母細胞和717#樹脂的重量比為22:70；其中，提取NAD+的具體步驟如下：S1、酸化：向清液B中加入濃度為6.5摩爾/升的鹽酸調節pH為1.98得到溶液C；S2、交換：將S1中得到的溶液C以19毫升/分鐘的速度上122#柱，上柱結束後，用蒸餾水以18毫升/分鐘的速度洗滌，其中，溶液C與蒸餾水的體積比為1:2.8；S3、洗脫：調節液面距122#柱上層樹脂層4.8厘米，用濃度為0.35摩爾/升的氨水以6.5毫升/分鐘的速度洗脫，當洗脫液pH＝7.3時，開始收集洗脫液D，其中溶液C的體積與氨水的總體積的比為1:2.8；S4、去鹽：向S3中得到的洗脫液D中加入732#樹脂，邊加邊攪拌，至pH為4.97，過濾得濾液，用蒸餾水洗滌樹脂得洗液，合併濾液和洗液得到溶液E；S5、分離：用氨水調節S4中得到溶液E至pH為7.2，室溫放置7天后，以4.5毫升/分鐘的速度上717#樹脂柱，上柱結束後，用45毫升蒸餾水以6.5毫升/分鐘的速度洗滌；S6、洗脫：取濃度為0.09摩爾/升氯化鉀溶液55毫升，以4.5毫升/分鐘的速度洗脫，收集洗脫液，洗脫液以4毫升/分鐘的速度上769型炭柱，用35毫升蒸餾水以5.5毫升/分鐘的速度洗滌後，用混合溶劑以0.9毫升/分鐘的速度洗脫NAD+，其中，混合溶劑由醋酸乙酯、丙酮、水和氨水組成，混合溶劑中醋酸乙酯、丙酮、水和氨水的體積比為100:400:500:2；S7、收集：分步收集洗脫液，用丙酮測試洗脫液有無沉澱，合併有沉澱的洗脫液，用5.8摩爾/升硝酸調節pH至2.3，立即加入以有沉澱的洗脫液體積份為基準的3倍的冷丙酮靜置35分鐘，去上清液，以3500轉的速度，離心3分鐘，去上清液，乾燥得到NAD+，其中冷丙酮的溫度為-12℃。

• 實施例4

《一種氧化型輔酶I的製備方法》包括如下步驟：破碎酵母細胞和提取NAD+；其中，破碎酵母細胞的具體步驟為：將酵母細胞加入濃度為0.06摩爾/升的鹽酸中浸泡2小時後，加熱至90℃，保溫5分鐘，加冰塊以14℃/分鐘的速度冷卻至室溫，以4500轉的速度進行離心15分鐘得到清液A；攪拌15小時，攪拌過程中加入717#樹脂，攪拌結束後過濾得到清液B，其中酵母細胞和鹽酸重量體積比克/毫升）為18:300，酵母細胞和717#樹脂的重量比為18:55；其中，提取NAD+的具體步驟如下：S1、酸化：向清液B中加入濃度為5-7摩爾/升的鹽酸調節pH為2.02得到溶液C；S2、交換：將S1中得到的溶液C以16毫升/分鐘的速度上122#柱，上柱結束後，用蒸餾水以22毫升/分鐘的速度洗滌，其中，溶液C與蒸餾水的體積比為1:2.2；S3、洗脫：調節液面距122#柱上層樹脂層4.2厘米，用濃度為0.45摩爾/升的氨水以5.5毫升/分鐘的速度洗脫，當洗脫液pH＝7.7時，開始收集洗脫液D，其中溶液C的體積與氨水的總體積的比為1:2.2；S4、去鹽：向S3中得到的洗脫液D中加入732#樹脂，邊加邊攪拌，至pH為5.03，過濾得濾液，用蒸餾水洗滌樹脂得洗液，合併濾液和洗液得到溶液E；S5、分離：用氨水調節S4中得到溶液E至pH為6.7，室溫放置8天后，以4毫升/分鐘的速度上717#樹脂柱，上柱結束後，用55毫升蒸餾水以5.5毫升/分鐘的速度洗滌；S6、洗脫：取濃度為0.11摩爾/升氯化鉀溶液65毫升，以4毫升/分鐘的速度洗脫，收集洗脫液，洗脫液以4.5毫升/分鐘的速度上769型炭柱，用25毫升蒸餾水以6.5毫升/分鐘的速度洗滌後，用混合溶劑以0.7毫升/分鐘的速度洗脫NAD+，其中，混合溶劑由醋酸乙酯、丙酮、水和氨水組成，混合溶劑中醋酸乙酯、丙酮、水和氨水的體積比為100:400:500:2；S7、收集：分步收集洗脫液，用丙酮測試洗脫液有無沉澱，合併有沉澱的洗脫液，用6.2摩爾/升硝酸調節pH至2.7，立即加入以有沉澱的洗脫液體積份為基準的2倍的冷丙酮靜置45分鐘，去上清液，以2500轉的速度，離心4分鐘，去上清液，乾燥得到NAD+，其中冷丙酮的溫度為-10℃。

• 實施例5

《一種氧化型輔酶I的製備方法》包括如下步驟：破碎酵母細胞和提取NAD+；其中，破碎酵母細胞的具體步驟為：將20克酵母細胞加入濃度為0.1摩爾/升的120毫升鹽酸中浸泡1小時後，加熱至95℃，保溫4分鐘，加冰塊以13℃/分鐘的速度冷卻至室溫，以5000轉的速度進行離心10分鐘得到清液A；攪拌14小時，攪拌過程中加入60克的717#樹脂，攪拌結束後過濾得到清液B；其中，提取NAD+的具體步驟如下：S1、酸化：向清液B中加入濃度為6摩爾/升的鹽酸調節pH為2得到溶液C；S2、交換：將S1中得到的溶液C以18毫升/分鐘的速度上122#柱，上柱結束後，用蒸餾水以20毫升/分鐘的速度洗滌，其中，溶液C與蒸餾水的體積比為1:2.5；S3、洗脫：調節液面距122#柱上層樹脂層4.5厘米，用濃度為0.4摩爾/升的氨水以6毫升/分鐘的速度洗脫，當洗脫液pH＝7.5時，開始收集洗脫液D，其中溶液C的體積與氨水的總體積的比為1:2.5；S4、去鹽：向S3中得到的洗脫液D中加入732#樹脂，邊加邊攪拌，至pH為5，過濾得濾液，用蒸餾水洗滌樹脂得洗液，合併濾液和洗液得到溶液E；S5、分離：用氨水調節S4中得到溶液E至pH為7，室溫放置7天后，以4.2毫升/分鐘的速度上717#樹脂柱，上柱結束後，用50毫升蒸餾水以6毫升/分鐘的速度洗滌；S6、洗脫：取濃度為0.1摩爾/升氯化鉀溶液60毫升，以4.3毫升/分鐘的速度洗脫，收集洗脫液，洗脫液以4.2毫升/分鐘的速度上769型炭柱，用30毫升蒸餾水以6毫升/分鐘的速度洗滌後，用混合溶劑以1毫升/分鐘的速度洗脫NAD+，其中，混合溶劑由醋酸乙酯、丙酮、水和氨水組成，混合溶劑中醋酸乙酯、丙酮、水和氨水的體積比為100:400:500:2；S7、收集：分步收集洗脫液，用丙酮測試洗脫液有無沉澱，合併有沉澱的洗脫液，用6摩爾/升硝酸調節pH至2.5，立即加入以有沉澱的洗脫液體積份為基準的4倍的冷丙酮靜置30分鐘，去上清液，以3000轉的速度，離心2分鐘，去上清液，乾燥沉澱得到NAD+，其中冷丙酮的溫度為-15℃。

• 實施例6

《一種氧化型輔酶I的製備方法》包括如下步驟：破碎酵母細胞和提取NAD+；其中，破碎酵母細胞的具體步驟為：將20克酵母細胞加入濃度為0.1摩爾/升的240毫升鹽酸中浸泡1小時後，加熱至95℃，保溫4分鐘，加冰塊以13℃/分鐘的速度冷卻至室溫，以5000轉的速度進行離心10分鐘得到清液A；攪拌14小時，攪拌過程中加入60克的717#樹脂，攪拌結束後過濾得到清液B；其中，提取NAD+的具體步驟同實施例5。

• 實施例7

《一種氧化型輔酶I的製備方法》包括如下步驟：破碎酵母細胞和提取NAD+；其中，破碎酵母細胞的具體步驟為：將20克酵母細胞加入濃度為0.1摩爾/升的400毫升鹽酸中浸泡1小時後，加熱至95℃，保溫4分鐘，加冰塊以13℃/分鐘的速度冷卻至室溫，以5000轉的速度進行離心10分鐘得到清液A；攪拌14小時，攪拌過程中加入60克的717#樹脂，攪拌結束後過濾得到清液B；其中，提取NAD+的具體步驟同實施例5。

• 實施例8

《一種氧化型輔酶I的製備方法》包括如下步驟：破碎酵母細胞和提取NAD+；其中，破碎酵母細胞的具體步驟為：將20克酵母細胞加入濃度為0.1摩爾/升的240毫升鹽酸中浸泡2小時後，加熱至95℃，保溫4分鐘，加冰塊以13℃/分鐘的速度冷卻至室溫，以5000轉的速度進行離心10分鐘得到清液A；攪拌14小時，攪拌過程中加入60克的717#樹脂，攪拌結束後過濾得到清液B；其中，提取NAD+的具體步驟同實施例5。試驗例1用高效液相色譜，根據外標法測定實施例5-8中，1克酵母細胞所含的輔酶I的重量，並與用熱處理法製備得到的輔酶I作比較。熱處理法製備清液a的方法為：將20克酵母細胞加入到20克純化水中，加熱至95℃，保溫5分鐘，加冰塊以13℃/分鐘的速度冷卻至室溫，以5000轉的速度進行離心10分鐘得到清液a。高效液相色譜檢測條件如下：流動相：緩衝鹽（25摩爾/升三乙胺，磷酸調pH至6.0）：乙腈＝95:5（v/v）固定相：5C18-MS-Ⅱ，4.6ID×250毫米流速＝1.0毫升/分鐘，柱溫＝25℃，檢測波長＝254納米，進樣量＝20μl溶液配製如下：標準品溶液：精密稱取輔酶I標準品0.1克加1升水製得。供試品溶液5、6、7、8：依次取實施例5-8的離心清液A各2毫升過濾得。供試品溶液9：用熱處理法製備得到清液a，取清液a2毫升過濾得。分別精密移取上述標準品溶液、供試品溶液5、6、7、8、9，依次進樣，記錄色譜圖20分鐘，按峰面積以外標法計算，計算公式如下：

測試結果如下：

供試品溶液	標準品溶液濃度 克/升	標準品溶液峰面積	供試品溶液峰面積	清液A總量 毫升	酵母重量 克	1克酵母細胞中輔酶I的重量 克
5	0.1	1497325.82	2494300.27	161.64	20	1.35x10
6	0.1	1497325.82	688190.14	360	20	8.27x10
7	0.1	1497325.82	480186.499	610	20	9.78x10
8	0.1	1497325.82	1369015.56	269.5	20	1.23x10
9	0.1	1497325.82	3897132.62	62.8	20	7.76x10

上述計算公式和表格中“清液A總量”，對於供試品溶液9來說，表示的是“清液a總量”。

榮譽表彰

2021年8月16日，《一種氧化型輔酶I的製備方法》獲得安徽省第八屆專利獎優秀獎。