《一種昆蟲細胞表達抗菌肽CecropinDC1的方法》是廣州市科瑋生物技術有限公司於2015年9月24日申請的專利，該專利的公布號為CN105200084A，授權公布日為2015年12月30日，發明人是黃自然、陳松彬、倪彥燕。
《一種昆蟲細胞表達抗菌肽CecropinDC1的方法》涉及生物技術領域，根據天然抗菌肽的序列，利用基因工程，設計合成抗菌肽CecropinDC1的基因，構建含有抗菌肽Cecropin DC1基因的重組病毒，並利用Sf21細胞作為宿主，表達生產具有生物活性的重組抗菌肽Cecropin DC1。
2017年12月11日，《一種昆蟲細胞表達抗菌肽CecropinDC1的方法》獲得第十九屆中國專利優秀獎。
基本介紹
- 中文名：一種昆蟲細胞表達抗菌肽CecropinDC1的方法
- 申請人：廣州市科瑋生物技術有限公司
- 申請日：2015年9月24日
- 申請號：2015106161213
- 公布日：2015年12月30日
- 公布號：CN105200084A
- 發明人：黃自然、陳松彬、倪彥燕
- 地址：廣東省廣州市經濟開發區保稅區保盈大道39號
- Int.Cl.：C12N15/866(2006.01)I、C07K14/435(2006.01)I、C12N15/12(2006.01)I
- 代理機構：廣州市深研專利事務所
- 代理人：陳雅平
- 類別：發明專利
專利背景,發明內容,專利目的,技術方案,有益效果,附圖說明,權利要求,實施方式,榮譽表彰,
專利背景
抗菌肽是一類具有生物活性的小分子鹼性多肽，具有殺菌力強、抗菌譜廣、穩定性好及不產生耐藥性等優點，更為重要的是抗菌肽對真核細胞幾乎沒作用，僅作用於原核細胞及發生病變的真核細胞。
2015年9月之前的技術查閱發現中國專利ZL200510032743.8公布了一種抗菌肽DC及其製備方法與套用，根據天然抗微諒束菌肽的序列，設計、合成抗菌肽DC基因，選擇酵母偏愛的遺傳密碼子，轉化穿梭質粒，轉入季也蒙念球菌中表達。但目的基因DC在季也蒙念球菌中的表達量受到限制、質粒轉化體不穩定，目的基因容易丟失紙拒燥拔等缺點。
發明內容
專利目的
《一種昆蟲細胞表達抗菌肽CecropinDC1的方法》的目的是在於提供一種昆蟲細胞表達抗菌肽CecropinDC1的方法，利用基因工程，構建含有抗菌肽CecropinDC1基因的重組病毒，並利用Sf21細胞作為宿主，表達生產具有生物活性的重組抗菌肽CecropinDC1。
技術方案
《一種昆蟲細胞表達抗菌肽CecropinDC1的方法》通過以下技術方案來實現：
1、一種昆蟲細胞表達抗菌肽CecropinDC1，通過點突變技術，將第38位賴氨酸的密碼子AAG改為天冬醯胺的密碼子AAC。此處胺基酸密碼子的改變對表達產物的殺菌活性明顯的提高。
2、所述的昆蟲細胞表達CecropinDC1，其胺基酸序列如SEQIDNO：2所示。
3、一種昆蟲細胞表達CecropinDC1的重組核苷酸序列，包含SEQIDNO：1所示的核苷酸序列。
4、一種昆蟲細胞表達抗菌肽CecropinDC1的方法，包括以下步驟：
1）構建包含SEQIDNO：1所示核苷酸序列的重組桿狀病毒轉移載體。
2）將構建好的重組轉移載體與苜蓿銀蚊夜蛾多核型多角體病毒AcNPV-DNA共轉染Sf21昆蟲細胞，按以下方式獲得表達抗菌肽Cecropin的重組病毒。
在1.5毫升滅菌的Eppendorf管中加入2微克重組轉移載體DNA、10微克AcNPV-DNA及0.8毫升共轉染緩衝液，將該混合物在室溫下孵育30分鐘後共轉染對數期的Sf21昆蟲細胞；然後將共轉染後的Sf21細胞先用無血清培養基Sf-900IISFM培養基清洗兩次，再用含有10%FBS的完全培養基在27℃下培養4~6天，收集培養基上清作為病毒原液用來篩選重組病喇櫃兆毒，重組病毒經過空斑篩選，獲得病毒溶液，該病毒溶液命名為含有抗菌肽CecropinDC1基因的重組病毒。
3）重組病毒感染旺盛生長的Sf21細胞，27℃培養4~6天進行感染表達，之後通過離心收集培養液。
有益效果
與2015年9月之前的技術相比，《一種昆蟲細胞表達抗菌肽CecropinDC1的方法》具有的有益效果是：
1、抗菌肽CecropinDC1是一個經過修飾改進的基因。將第38位的賴氨酸改為天冬醯胺，這種胺基酸密碼子的改變使其具有較高的殺菌效價，特別是對多種病原微生物有較好的抑菌作用，如大腸桿菌、金黃葡萄球菌等。
2、該發明解決了抗菌肽CecropinDC1在季也蒙念球菌表達中質粒轉化體不穩定，目的基因容易丟失和在哺乳動物細胞生產成本太高等缺點，獲得的Sf21細胞表達重組抗菌肽CecropinDC1具有較高的生物活性，且大部分被分泌到培養定套基中，有利於蛋白的快速提驗嬸境承取純化。該發明的抗菌肽CecropinDC1可以大量生產，並且為抗菌肽CecropinDC1在醫學、食品和化妝品上幾謎悼的套用開闢了廣闊的前景。
附圖說明
圖1是抗菌肽CecropinDC1的PCR擴增產物；
1：目的基因PCR產物，M：Marker。
圖2是該發明抗菌肽CecropinDC1抗菌活性定量測定；
1：抗菌肽CecropinDC1發酵液，2：抗菌肽DC發酵液，3：無菌水。
圖3是該發明抗菌肽抗菌肽CecropinDC1抗菌活性定性測定；
CK：無菌水，CK：Amp，1：抗菌肽DC，2：抗菌肽CecropinDC1。
權利要求
1.《一種昆蟲細胞表達抗菌肽CecropinDC1的方法》其特徵在於：通過點良棄市突變技術，將抗菌肽DC的第38位賴氨酸的密碼子AAG改為天冬醯胺的密碼子AAC。
2.權利要求1所述的昆蟲細胞表達的CecropinDC1，其胺基酸序列為SEQIDNO：2所示。
3.權利要求1所述的昆蟲細胞表達的CecropinDC1，其核苷酸序列為SEQIDNO：1所示。
4.一種昆蟲細胞表達抗菌肽CecropinDC1的方法，其特徵在於，包括以下步驟：
1）構建包含SEQIDNO：1所示核苷酸序列的重組桿狀病毒轉移載體；
2）將構建好的重組轉移載體與苜蓿銀蚊夜蛾多核型多角體病毒AcNPV-DNA共轉染Sf21昆蟲細胞，按以下方式獲得表達抗菌肽Cecropin的重組病毒：
在1.5毫升滅菌的Eppendorf管中加入2微克重組轉移載體DNA、10微克AcNPV-DNA及0.8毫升共轉染緩衝液，將該混合物在室溫下孵育30分鐘後共轉染對數期的Sf21昆蟲細胞；然後將共轉染後的Sf21細胞先用無血清培養基Sf-900IISFM培養基清洗兩次，再用含有10%FBS的完全培養基在27℃下培養4~6天，收集培養基上清作為病毒原液用來篩選重組病毒，重組病毒經過空斑篩選，獲得病毒溶液，該病毒溶液命名為含有抗菌肽CecropinDC1基因的重組病毒；
3）重組病毒感染生長旺盛的Sf21細胞，27℃培養4~6天進行感染表達，之後通過離心收集培養液。
實施方式
實施例1
抗菌肽CecropinDC1基因的克隆
根據抗菌肽CecropinDC1基因改造和克隆的需要，利用Primerpremier5.0軟體設計、合成引物：
P1：5’ATGAAATGGAAGTTGTTCAAAAA3’；P2：5’GTTAGCCAAGGCAGTAGC3’。
所述PCR擴增反應為：93℃預變性5分鐘；93℃變性30秒；58℃退火60秒；72℃延伸1分鐘；30個循環後，72℃延伸10分鐘，4℃保溫。
用1%瓊脂糖凝膠電泳對抗菌肽CecropinDC1基因進行PCR產物分析（結果如圖1所示）泳道1與DNA分子量Marker（DL2000）相對比可以清楚的看到140左右的目的片段，說明成功合成了抗菌肽CecropinDC1基因。膠回收試劑盒（GelExtractionKit，OMEGA公司）回收純化目的基因。並將隨機選取的質粒送金唯智基因公司測序。
實施例2
獲得重組病毒
將構建好的重組轉移載體與苜蓿銀蚊夜蛾多核型多角體病毒AcNPV-DNA共轉染Sf21昆蟲細胞，按以下方式獲得表達抗菌肽CecropinDC1的重組病毒。
在1.5毫升滅菌的Eppendorf管中加入2微克重組轉移載體DNA、10微克AcNPV-DNA及0.8毫升共轉染緩衝液，將該混合物在室溫下培育30分鐘後共轉染對數生長期的Sf21昆蟲細胞；然後將共轉染後的Sf21細胞先用無血清培養基Sf-900IISFM培養基（不含抗生素或其它添加物）清洗兩次，再用含有10%FCS的新鮮培養基在27℃下培養4~6天，收集培養基上清作為病毒原液用來篩選重組病毒，重組病毒經過空斑篩選，獲得病毒溶液，該病毒溶液命名為含有抗菌肽CecropinDC1基因的重組病毒。
實施例3
重組桿狀病毒的提取
1）取1.5毫升離心管，加入20微升的ProteinaseK溶液。
2）向離心管中加入200微升血清或血漿，然後再加入200微升BufferGB，渦旋震盪15秒。
3）56℃孵育15分鐘，短暫離心，將管壁上的溶液收集到管底。
4）加入250微升無水乙醇，渦旋震盪15秒，室溫放置5分鐘，短暫離心，將管壁上的溶液收集到管底。
5）將一個SpinColumnsCG放入CollectionTubes（2毫升）中，將上一步所得溶液轉移到離心吸附柱中，10000轉每分離心30秒，棄收集管中的廢液。
6）向吸附柱內加入500微升的BufferGD，室溫10000轉每分離心30秒，棄收集管中廢液。
7）向吸附柱內加入500微升的BufferPW，室溫10000轉每分離心30秒，棄收集管中廢液。
8）向吸附柱中加入500微升無水乙醇，10000轉每分離心30秒，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱重新放回收集管中。
9）室溫12000轉每分離心3分鐘，甩乾殘留液體。
10）將離心吸附柱置於一個新的1.5毫升EP管中，小心打開吸附柱的蓋子，室溫放置3分鐘，使吸附膜完全變乾。加入30~100微升的洗脫液，室溫放置2~5分鐘。12000轉每分離心1分鐘，離心管底溶液即病毒DNA。
實施例4
抗菌肽CecropinDC1的活性分析鑑定
1）重組病毒感染生長旺盛的Sf21細胞，27℃培養4~6天后進行感染表達，離心收集上清液。
2）瓊脂孔擴散法測定抗菌肽CecropinDC1抑菌活性
①將大腸桿菌E.coliK12D31在LB固體平板上劃線，37℃培養過夜。
②挑取單菌落，接種於3~5毫升的LB液體培養基中，37℃、220轉/分鐘振盪培養過夜。
③按1~2%的體積比率將培養過夜的菌液接種於適量的LB液體培養基中，37℃、250轉/分鐘振盪培養3小時左右，當OD600≈0.6~0.8時，進行抑菌試驗。
④將LB固體培養基加熱融化，當培養基溫度降至45℃左右時，將對數期的大腸桿菌E.coliK12D31按2%的接種量與LB培養基混勻，傾倒平板，待平板凝固後放入4℃冰櫃中冷卻保存。用2.7毫米直徑打孔器打孔，每孔注入10微升發酵液，對照孔加入無菌水。每處理重複3次，倒置培養皿，37℃培養過夜。培養皿上出現不同大小的抑菌圈（結果如圖2所示），用卡尺測定各抑菌圈的直徑（毫米），取平均值。按以下公式計算其殺菌效價。
抗菌肽CecropinDC1發酵液對大腸桿菌E.coliK12D31抑菌圈的平均直徑為8.5毫米，殺菌效價為6782IU/毫升；抗菌肽DC發酵液對大腸桿菌E.coliK12D31抑菌圈的平均直徑為7.9毫米，殺菌效價為5563IU/毫升。由此可以說明，昆蟲細胞表達的抗菌肽CecropinDC1的抑菌效果優於季也蒙念球菌表達的抗菌肽DC的抑菌效果。
3）酶標儀法測定抗菌肽CecropinDC1抑菌曲線
取對數生長期的大腸桿菌E.coliK12D31加入96孔板中，每孔加80微升供試液，再加入20微升的樣品至終體積為100微升。設空白對照（無菌水）和陽性對照（Amp）。混勻後，用酶標儀測第一個值（OD），之後37℃孵化，每隔一小時用酶標儀測OD570，共測5~6小時，以抑菌曲線表示其抗菌活性。每種處理設三個重複，取其平均值，並獲得標準誤。結果如圖3所示：與抗生素氨苄黴素相比，抗菌肽CecropinDC1和抗菌肽DC的發酵液的抑菌效果都明顯優於陽性對照Amp，並且抗菌肽CecropinDC1發酵液的抑菌效果優於抗菌肽DC發酵液。說明抗菌肽CecropinDC1發酵液的抑菌活性高於抗菌肽DC發酵液的抑菌活性，與瓊脂孔擴散法的實驗結果吻合，說明昆蟲表的的抗菌肽CecropinDC1的抑菌活性高於季也蒙念球菌表達的抗菌肽DC的抑菌活性。
附序列表：
序列表
榮譽表彰
2017年12月11日，《一種昆蟲細胞表達抗菌肽CecropinDC1的方法》獲得第十九屆中國專利優秀獎。
3）重組病毒感染旺盛生長的Sf21細胞，27℃培養4~6天進行感染表達，之後通過離心收集培養液。
有益效果
與2015年9月之前的技術相比，《一種昆蟲細胞表達抗菌肽CecropinDC1的方法》具有的有益效果是：
1、抗菌肽CecropinDC1是一個經過修飾改進的基因。將第38位的賴氨酸改為天冬醯胺，這種胺基酸密碼子的改變使其具有較高的殺菌效價，特別是對多種病原微生物有較好的抑菌作用，如大腸桿菌、金黃葡萄球菌等。
2、該發明解決了抗菌肽CecropinDC1在季也蒙念球菌表達中質粒轉化體不穩定，目的基因容易丟失和在哺乳動物細胞生產成本太高等缺點，獲得的Sf21細胞表達重組抗菌肽CecropinDC1具有較高的生物活性，且大部分被分泌到培養基中，有利於蛋白的快速提取純化。該發明的抗菌肽CecropinDC1可以大量生產，並且為抗菌肽CecropinDC1在醫學、食品和化妝品上的套用開闢了廣闊的前景。
附圖說明
圖1是抗菌肽CecropinDC1的PCR擴增產物；
1：目的基因PCR產物，M：Marker。
圖2是該發明抗菌肽CecropinDC1抗菌活性定量測定；
1：抗菌肽CecropinDC1發酵液，2：抗菌肽DC發酵液，3：無菌水。
圖3是該發明抗菌肽抗菌肽CecropinDC1抗菌活性定性測定；
CK：無菌水，CK：Amp，1：抗菌肽DC，2：抗菌肽CecropinDC1。
權利要求
1.《一種昆蟲細胞表達抗菌肽CecropinDC1的方法》其特徵在於：通過點突變技術，將抗菌肽DC的第38位賴氨酸的密碼子AAG改為天冬醯胺的密碼子AAC。
2.權利要求1所述的昆蟲細胞表達的CecropinDC1，其胺基酸序列為SEQIDNO：2所示。
3.權利要求1所述的昆蟲細胞表達的CecropinDC1，其核苷酸序列為SEQIDNO：1所示。
4.一種昆蟲細胞表達抗菌肽CecropinDC1的方法，其特徵在於，包括以下步驟：
1）構建包含SEQIDNO：1所示核苷酸序列的重組桿狀病毒轉移載體；
2）將構建好的重組轉移載體與苜蓿銀蚊夜蛾多核型多角體病毒AcNPV-DNA共轉染Sf21昆蟲細胞，按以下方式獲得表達抗菌肽Cecropin的重組病毒：
在1.5毫升滅菌的Eppendorf管中加入2微克重組轉移載體DNA、10微克AcNPV-DNA及0.8毫升共轉染緩衝液，將該混合物在室溫下孵育30分鐘後共轉染對數期的Sf21昆蟲細胞；然後將共轉染後的Sf21細胞先用無血清培養基Sf-900IISFM培養基清洗兩次，再用含有10%FBS的完全培養基在27℃下培養4~6天，收集培養基上清作為病毒原液用來篩選重組病毒，重組病毒經過空斑篩選，獲得病毒溶液，該病毒溶液命名為含有抗菌肽CecropinDC1基因的重組病毒；
3）重組病毒感染生長旺盛的Sf21細胞，27℃培養4~6天進行感染表達，之後通過離心收集培養液。
實施方式
實施例1
抗菌肽CecropinDC1基因的克隆
根據抗菌肽CecropinDC1基因改造和克隆的需要，利用Primerpremier5.0軟體設計、合成引物：
P1：5’ATGAAATGGAAGTTGTTCAAAAA3’；P2：5’GTTAGCCAAGGCAGTAGC3’。
所述PCR擴增反應為：93℃預變性5分鐘；93℃變性30秒；58℃退火60秒；72℃延伸1分鐘；30個循環後，72℃延伸10分鐘，4℃保溫。
用1%瓊脂糖凝膠電泳對抗菌肽CecropinDC1基因進行PCR產物分析（結果如圖1所示）泳道1與DNA分子量Marker（DL2000）相對比可以清楚的看到140左右的目的片段，說明成功合成了抗菌肽CecropinDC1基因。膠回收試劑盒（GelExtractionKit，OMEGA公司）回收純化目的基因。並將隨機選取的質粒送金唯智基因公司測序。
實施例2
獲得重組病毒
將構建好的重組轉移載體與苜蓿銀蚊夜蛾多核型多角體病毒AcNPV-DNA共轉染Sf21昆蟲細胞，按以下方式獲得表達抗菌肽CecropinDC1的重組病毒。
在1.5毫升滅菌的Eppendorf管中加入2微克重組轉移載體DNA、10微克AcNPV-DNA及0.8毫升共轉染緩衝液，將該混合物在室溫下培育30分鐘後共轉染對數生長期的Sf21昆蟲細胞；然後將共轉染後的Sf21細胞先用無血清培養基Sf-900IISFM培養基（不含抗生素或其它添加物）清洗兩次，再用含有10%FCS的新鮮培養基在27℃下培養4~6天，收集培養基上清作為病毒原液用來篩選重組病毒，重組病毒經過空斑篩選，獲得病毒溶液，該病毒溶液命名為含有抗菌肽CecropinDC1基因的重組病毒。
實施例3
重組桿狀病毒的提取
1）取1.5毫升離心管，加入20微升的ProteinaseK溶液。
2）向離心管中加入200微升血清或血漿，然後再加入200微升BufferGB，渦旋震盪15秒。
3）56℃孵育15分鐘，短暫離心，將管壁上的溶液收集到管底。
4）加入250微升無水乙醇，渦旋震盪15秒，室溫放置5分鐘，短暫離心，將管壁上的溶液收集到管底。
5）將一個SpinColumnsCG放入CollectionTubes（2毫升）中，將上一步所得溶液轉移到離心吸附柱中，10000轉每分離心30秒，棄收集管中的廢液。
6）向吸附柱內加入500微升的BufferGD，室溫10000轉每分離心30秒，棄收集管中廢液。
7）向吸附柱內加入500微升的BufferPW，室溫10000轉每分離心30秒，棄收集管中廢液。
8）向吸附柱中加入500微升無水乙醇，10000轉每分離心30秒，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱重新放回收集管中。
9）室溫12000轉每分離心3分鐘，甩乾殘留液體。
10）將離心吸附柱置於一個新的1.5毫升EP管中，小心打開吸附柱的蓋子，室溫放置3分鐘，使吸附膜完全變乾。加入30~100微升的洗脫液，室溫放置2~5分鐘。12000轉每分離心1分鐘，離心管底溶液即病毒DNA。
實施例4
抗菌肽CecropinDC1的活性分析鑑定
1）重組病毒感染生長旺盛的Sf21細胞，27℃培養4~6天后進行感染表達，離心收集上清液。
2）瓊脂孔擴散法測定抗菌肽CecropinDC1抑菌活性
①將大腸桿菌E.coliK12D31在LB固體平板上劃線，37℃培養過夜。
②挑取單菌落，接種於3~5毫升的LB液體培養基中，37℃、220轉/分鐘振盪培養過夜。
③按1~2%的體積比率將培養過夜的菌液接種於適量的LB液體培養基中，37℃、250轉/分鐘振盪培養3小時左右，當OD600≈0.6~0.8時，進行抑菌試驗。
④將LB固體培養基加熱融化，當培養基溫度降至45℃左右時，將對數期的大腸桿菌E.coliK12D31按2%的接種量與LB培養基混勻，傾倒平板，待平板凝固後放入4℃冰櫃中冷卻保存。用2.7毫米直徑打孔器打孔，每孔注入10微升發酵液，對照孔加入無菌水。每處理重複3次，倒置培養皿，37℃培養過夜。培養皿上出現不同大小的抑菌圈（結果如圖2所示），用卡尺測定各抑菌圈的直徑（毫米），取平均值。按以下公式計算其殺菌效價。
抗菌肽CecropinDC1發酵液對大腸桿菌E.coliK12D31抑菌圈的平均直徑為8.5毫米，殺菌效價為6782IU/毫升；抗菌肽DC發酵液對大腸桿菌E.coliK12D31抑菌圈的平均直徑為7.9毫米，殺菌效價為5563IU/毫升。由此可以說明，昆蟲細胞表達的抗菌肽CecropinDC1的抑菌效果優於季也蒙念球菌表達的抗菌肽DC的抑菌效果。
3）酶標儀法測定抗菌肽CecropinDC1抑菌曲線
取對數生長期的大腸桿菌E.coliK12D31加入96孔板中，每孔加80微升供試液，再加入20微升的樣品至終體積為100微升。設空白對照（無菌水）和陽性對照（Amp）。混勻後，用酶標儀測第一個值（OD），之後37℃孵化，每隔一小時用酶標儀測OD570，共測5~6小時，以抑菌曲線表示其抗菌活性。每種處理設三個重複，取其平均值，並獲得標準誤。結果如圖3所示：與抗生素氨苄黴素相比，抗菌肽CecropinDC1和抗菌肽DC的發酵液的抑菌效果都明顯優於陽性對照Amp，並且抗菌肽CecropinDC1發酵液的抑菌效果優於抗菌肽DC發酵液。說明抗菌肽CecropinDC1發酵液的抑菌活性高於抗菌肽DC發酵液的抑菌活性，與瓊脂孔擴散法的實驗結果吻合，說明昆蟲表的的抗菌肽CecropinDC1的抑菌活性高於季也蒙念球菌表達的抗菌肽DC的抑菌活性。
附序列表：
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榮譽表彰
2017年12月11日，《一種昆蟲細胞表達抗菌肽CecropinDC1的方法》獲得第十九屆中國專利優秀獎。
