《一種新型高效單寧醯基水解酶的晶體結構及其催化機制》是依託四川大學，由黃文擔任項目負責人的面上項目。
基本介紹
- 中文名：一種新型高效單寧醯基水解酶的晶體結構及其催化機制
- 項目類別：面上項目
- 項目負責人：黃文
- 依託單位：四川大學
項目摘要,結題摘要,
項目摘要
鞣花單寧的生物毒性和結構複雜性使其成為植物多酚生物降解領域的難題。單寧醯基水解酶是鞣花單寧生物降解的關鍵酶，其結構功能不明是嚴重製約植物多酚生物降解理論和套用發展的瓶頸問題之一。本項目以課題組前期研究中發現的一種新型高效鞣花單寧醯基水解酶（Ellagitannin acly hydrolase, EAH）為研究對象，採用已建立的化學修飾方法合成具有典型鞣花單寧結構特徵的底物類似物硫酚，將其與EAH反應形成酶-底複合物；基於已建立的EAH晶體的結晶技術獲得酶-底複合物晶體，使用本所X-ray儀衍射獲取EAH及酶-底複合物的三維分子結構信息，明確酶-底結合位點；通過體外定點突變獲得結合位點上編碼胺基酸置換的EAH突變體，以確定EAH活性位點，闡明EAH催化機制。本研究不僅對拓寬鞣花單寧這一可再生資源利用具有重要的現實意義，而且對推動植物多酚生物降解理論發展具有重要的科學價值。
結題摘要
鞣花單寧的生物毒性和結構複雜性使其成為植物多酚生物降解領域的難題。單寧醯基水解酶是鞣花單寧生物降解的關鍵酶。本項目對前期研究中發現的新型高效鞣花單寧醯基水解酶（EAH）進行研究，在本基金的資助下獲得如下研究進展：（1）合成了具有典型鞣花單寧結構特徵的底物類似物栗木鞣花素、赤芍素及鞣雲實素的硫酚，研究顯示EAH沒能對硫酚發生水解反應，證實了鞣花單寧的酚羥基是影響底物與酶的結合的功能基團，並發現合成的底物類似物硫酚的清除自由基活性提高200倍。（2）EAH經純化後經β巰基乙醇還原和未經還原的EAH均顯示為單一的條帶，說明該EAH為單體蛋白，無亞基結構，依據標準蛋白可看出EAH的相對分子量與已經報導過的單寧酶分子量均不一樣，這表明EAH是一種新的單寧酶。（3）通過圓二色性光譜及蛋白擬合軟體CDNN等手段對EAH二級結構研究發現，其α螺旋結構占14%，反向β摺疊占32.4%，β摺疊占4.8%，β轉角占18.8%，無規則結構占29.9%，單寧酶的Trp殘基處在一個疏水的環境中。由二級結構組成比例可知，β結構是結構組成中主要部分。（4）基於已建立的結晶方法獲得EAH晶體，使用X-ray儀衍射獲取EAH的三維分子結構信息，在2.5埃的解析度上得到EAH的晶體結構，結果表明EAH是一個球蛋白且具有經典的β/α摺疊。（5）通過採用pNIC28-Bsa4載體進行LIC-PCR並將構建好的載體轉化BL21-DE3後得到EAH重組子，研究表明重組和野生EAH有類似的酶活性及底物特異性。（6）基於已建立的結晶方法獲得酶-底複合物晶體，使用X-ray儀衍射獲取的EAH酶-底複合物的三維分子結構信息，得到了EAH酶-底複合物的晶體結構，通過對定點突變獲得結合位點上編碼胺基酸置換的EAH突變體，突變分析發現位於催化中心入口處的378位芳香族胺基酸側鏈在底物結合中起重要作用，EAH的His410和Arg414突變使它對水解鞣花單寧時失活，表明His410和Arg414在特異性水解鞣花單寧過程中起關鍵作用。由於EAH為本課題特有，國外無此研究。 在本基金的資助下，已發表標註基金號“20972105”的SCI收錄論文13篇、EI收錄論文1篇及中文核心期刊論文1篇，培養在讀博士後1人，培養博士研究生3名，其中畢業2人，在讀1人，培養碩士研究生11名，其中畢業6人，在讀5人。
