一種抗VEGF-抗PD-1雙功能抗體及其套用

《一種抗VEGF-抗PD-1雙功能抗體及其套用》是安徽瀚海博興生物技術有限公司於2015年10月20日申請的發明專利，該專利申請號為2015106924845，公布號為CN105175545A，專利公布日為2015年12月23日，發明人是汪國興、胡思怡、袁紅、武婷。

《一種抗VEGF-抗PD-1雙功能抗體及其套用》公開了一種抗VEGF-抗PD-1雙功能抗體及其套用，屬於分子免疫學技術領域。該發明所提供的抗VEGF-抗PD-1雙功能抗體包含輕鏈和重鏈，其中，輕鏈的胺基酸序列如SEQ ID NO.2所示，重鏈的胺基酸序列如SEQ ID NO.4或SEQ ID NO.6所示。同時，該發明還提供了編碼雙功能抗體的基因以及雙功能抗體的套用。該發明所提供的雙功能抗體能夠與PD-1和VEGF結合，具有很高的親和力，同時能夠有效的刺激T細胞分泌IL2和誘導T細胞分泌IFN-γ，並能顯著抑制小鼠腫瘤生長，在製備抗腫瘤的藥物中的套用具有巨大的潛力。

2020年7月17日，《一種抗VEGF-抗PD-1雙功能抗體及其套用》獲得安徽省第七屆專利獎優秀獎。

基本介紹

• 中文名：一種抗VEGF-抗PD-1雙功能抗體及其套用
• 公布號：CN105175545A
• 公布日：2015年12月23日
• 申請號：2015106924845
• 申請日：2015年10月20日
• 申請人：安徽瀚海博興生物技術有限公司
• 地址：安徽省合肥市高新區望江西路800號創新產業園A3樓505室
• 代理機構：哈爾濱市陽光惠遠智慧財產權代理有限公司23211
• 代理人：耿曉岳
• Int.Cl.：C07K16/46(2006.01)I；C12N15/13(2006.01)I；A61K39/395(2006.01)I； A61P35/00(2006.01)I
• 發明人：汪國興、胡思怡、袁紅
• 類別：發明專利

專利背景

據WHO專家2015年預測：“到2020年，全球人口的腫瘤發病人數將達到2000萬人，死亡人數將達到1200萬人”。因此，腫瘤將成為21世紀人類第一大殺手，對人類生存構成最嚴重的威脅。隨著中國人口老齡化，患腫瘤疾病的人口會越來越多，因此開發抗腫瘤藥物也成為國家健康事業的重點。

血管內皮生長因子，又叫VEGF。VEGF蛋白是於1989年由美國的兩間生物科技公司的科學家分別成功純化與鑑定，並克隆與測定了其基因序列，證明VPF與VEGF是同一基因編碼的同一蛋白。VEGF有六個等型（isoforms）：VEGF-A，-B，-C，-D，及-E；其分子量從35至44kDa不等，每個等型特異性地與三個“血管內皮生長因子受體”（VEGFR-1，-2，及-3）的特定組合相結合。VEGF是高度保守的同源二聚體糖蛋白。二條分子量各為24kDa的單鏈以二硫鍵組成二聚體。VEGF分解的單體無活性，去除N2糖基對生物效應無影響，但可能在細胞分泌中起作用。由於mRNA不同的剪下方式，產生出分別VEGF121、VEGF145、VEGF165、VEGF185、VEGF206等至少5種蛋白形式，其中VEGF121、VEGF145、VEGF165是分泌型可溶性蛋白，能直接作用於血管內皮細胞促進血管內皮細胞增殖，增加血管通透性。1990年，美國哈佛大學Folkman博士提出著名的Folkman理論，即腫瘤組織生長，必須依靠新生血管生成來提供足夠的氧氣和營養物質來維持。被認為是VEGF臨床套用的基礎。抗VEGF與VEGFR結合的單克隆抗體，可抑制血管內皮生長因子，用於治療各類轉移性癌症。

程式性死亡受體1（programmed death1，PD-1）為CD28超家族成員。PD-1表達於活化的T細胞，B細胞及髓系細胞，其有兩個配體，即程式性死亡配體-1（programmed death ligand1，PD-L1）和PD-L2。PD-L1/L2在抗原遞呈細胞都表達，PD-L1在多種組織也有表達。PD-1與PD-L1的結合介導T細胞活化的共抑制信號，調節T細胞活化和增殖，起到類似於CTLA-4的負調節作用。華裔科學家陳列平實驗室首先發現PD-L1在腫瘤組織高表達，而且調節腫瘤浸潤CD8T細胞的功能。因此，以PD-1/PD-L1為靶點的免疫調節對抗腫瘤有重要的意義。近年來，已有多種Anti-PD-1/PD-L1抗體在腫瘤免疫治療的臨床研究迅速開展。截至2015年10月，Pembrolizumab和Nivolumab已被FDA批准用於晚期黑色素瘤，最近Nivolumab也已被美國FDA批准用於晚期鱗狀非小細胞肺癌的治療。另外，MPDL3280A（anti-PD-L1單抗），Avelumab（anti-PD-L1單抗）等也已進入多個晚期臨床研究中，覆蓋非小細胞癌，黑色素瘤，膀胱癌等多個瘤種。由於PD-1抗體的廣譜抗腫瘤前景和驚人的藥效，業界普遍認為針對PD-1通路的抗體將帶來治療多種腫瘤治療的突破性的進展：用於治療非小細胞性肺癌，腎細胞癌，卵巢癌，黑色素瘤，白血病以及貧血病等等。在2012年和2013年的美國癌症協會（AACR）年會以及美國臨床腫瘤協會（ASCO）年會上揭曉的關於PD-1抗體藥物的臨床藥效數據後，PD-1抗體成為全球製藥行業最炙手可熱的在研抗體藥物。

腫瘤免疫治療是套用免疫學原理和方法，提高腫瘤細胞的免疫原性和對效應細胞殺傷的敏感性，激發和增強機體抗腫瘤免疫應答，並套用免疫細胞和效應分子輸注宿主體內，協同機體免疫系統殺傷腫瘤、抑制腫瘤生長。腫瘤免疫治療近來備受關注，是腫瘤治療領域的焦點。截至2015年10月，腫瘤免疫治療的好訊息不斷，已在一些腫瘤類型如黑色素瘤，非小細胞肺癌等的治療中展示出了強大的抗腫瘤活性，並已有腫瘤免疫治療藥物獲得美國FDA（Foodand Drug Administration，FDA）批准臨床套用。腫瘤免疫治療由於其卓越的療效和創新性，在2013年被《科學》雜誌評為年度最重要的科學突破。腫瘤免疫治療有望成為繼手術，化療，放療，靶向治療後腫瘤治療領域的一場革新。

雙功能抗體，又叫雙特異性抗體，是一種非天然抗體，它能同時靶向兩種不同的靶點或蛋白。雙特異性抗體可以同時特異性結合兩個不同的抗原，由於其特異性和雙功能性在腫瘤免疫治療中的作用越來越重要。2014年12月03日美國FDA審批安進公司研發的雙特異性抗體Blincyto（Blinatumomab）上市，用於急性淋巴細胞白血病的治療。Blinatumomab為CD19、CD3雙特異性抗體，Blincyto（Blinatumomab）是美國FDA審批的第一個雙特性抗體。截至2015年10月，開發存在的雙功能抗體形式已被證明有超過40餘種，但是由於生產效率低和藥代動力學性能差等問題，一直以來雙特異性抗體的研發困難重重，世界各國尚沒有一種抗VEGF-抗PD-1雙功能抗體。

發明內容

專利目的

《一種抗VEGF-抗PD-1雙功能抗體及其套用》的目的在於提供一種抗VEGF-抗PD-1雙功能抗體。

技術方案

《一種抗VEGF-抗PD-1雙功能抗體及其套用》所述的雙功能抗體包含輕鏈和重鏈，其中，輕鏈的胺基酸序列如SEQ ID NO.2所示，重鏈的胺基酸序列如SEQ ID NO.4或SEQ ID NO.6所示。

優選地，所述雙功能抗體是抗VEGF-抗PD-1雙功能抗體BsAbB7，輕鏈的胺基酸序列如SEQ ID NO.2所示，重鏈的胺基酸序列如SEQ ID NO.4所示。

優選地，所述雙功能抗體是抗VEGF-抗PD-1雙功能抗體BsAbB8，輕鏈的胺基酸序列如SEQ ID NO.2所示，重鏈的胺基酸序列如SEQ ID NO.6所示。

該發明還提供了一種編碼所述抗VEGF-抗PD-1雙功能抗體的基因，該基因編碼輕鏈的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，編碼重鏈的核苷酸序列如SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.5所示。

優選地，所述基因中核苷酸序列SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.3分別編碼抗VEGF-抗PD-1雙功能抗體BsAbB7的輕鏈和重鏈。

優選地，所述基因中核苷酸序列SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.5分別編碼抗VEGF-抗PD-1雙功能抗體BsAbB8的輕鏈和重鏈。

所述任一抗體在製備預防、診斷、治療或輔助治療腫瘤的藥物中的套用也屬於該發明的保護範圍。

所述任一抗體在製備抗腫瘤的藥物中的套用也在該發明的保護範圍之內。

優選地，所述套用具體是在結合VEGF的藥物、阻斷VEGF信號通路、抑制腫瘤的藥物中套用。

優選地，所述套用具體是在結合PD-1的藥物、阻斷PD-1與PDL-1結合的藥物、激活T淋巴細胞的藥物、提高T淋巴細胞中IL-2、IFN-γ表達、抑制腫瘤的藥物中套用。

具體地，所述腫瘤選自肺癌、胃癌、肝癌、結腸直腸癌、黑色素瘤、腎瘤、卵巢癌、前列腺癌、膀胱癌、乳腺癌、食管癌、大腸癌、鼻咽癌、腦腫瘤、宮頸癌、血癌、骨癌、淋巴癌、胰臟癌等。

改善效果

《一種抗VEGF-抗PD-1雙功能抗體及其套用》所用的方法是目前治療腫瘤的一種新的前沿方法，腫瘤免疫治療有望成為繼手術，化療，放療，靶向治療後腫瘤治療領域的一場革新。該發明新發現的雙功能抗體BsAbB7和BsAbB8均能與PD-1結合，雙功能BsAbB7親和力為0.24納米，雙功能BsAbB8親和力為0.24納米。同時也能夠與VEGF結合，雙功能抗體BsAbB7親和力為0.15納米，雙功能抗體BsAbB8親和力為0.12納米。

附圖說明

圖1為PD-1和VEGF抗原的SDS-PAGE電泳結果；（其中，A為VEGF抗原；B為PD-1抗原）。

圖2為BsAb7和BsAb8的SDS-PAGE電泳結果圖；（其中，A為BsAb7的SDS-PAGE電泳結果；B為BsAb8的SDS-PAGE電泳結果）。

圖3為雙功能抗體BsAb7和BsAb8誘導T淋巴細胞分泌IL2能力測定結果。

圖4為雙功能抗體BsAb7和BsAb8誘導T淋巴細胞分泌IFN-γ能力測定結果。

技術領域

《一種抗VEGF-抗PD-1雙功能抗體及其套用》涉及一種抗VEGF-抗PD-1雙功能抗體及其套用，屬於分子免疫學技術領域。

權利要求

1.一種抗VEGF-抗PD-1雙功能抗體，包含輕鏈和重鏈，其特徵在於，輕鏈的胺基酸序列如SEQ ID NO.2所示，重鏈的胺基酸序列如SEQ ID NO.4或SEQ ID NO.6所示。

2.根據權利要求1所述一種抗VEGF-抗PD-1雙功能抗體，其特徵在於，輕鏈的胺基酸序列如SEQ ID NO.2所示，重鏈的胺基酸序列如SEQ ID NO.4所示。

3.根據權利要求1所述一種抗VEGF-抗PD-1雙功能抗體，其特徵在於，輕鏈的胺基酸序列如SEQ ID NO.2所示，重鏈的胺基酸序列如SEQ ID NO.6所示。

4.一種編碼權利要求1所述一種抗VEGF-抗PD-1雙功能抗體的基因，其特徵在於，編碼輕鏈的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，編碼重鏈的核苷酸序列如SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.5所示。

5.根據權利要求4所述基因，其特徵在於，所述核苷酸序列SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.3分別編碼抗VEGF-抗PD-1雙功能抗體的輕鏈和重鏈。

6.根據權利要求4所述基因，其特徵在於，所述核苷酸序列SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.5分別編碼抗VEGF-抗PD-1雙功能抗體的輕鏈和重鏈。

7.權利要求1-3所述任一抗體在製備預防、診斷、治療或輔助治療腫瘤的藥物中的套用。

8.權利要求1-3所述任一抗體在製備抗腫瘤的藥物中的套用。

9.根據權利要求8所述套用，其特徵在於，在結合VEGF的藥物、阻斷VEGF信號通路、抑制腫瘤的藥物中套用。

10.根據權利要求8所述套用，其特徵在於，在結合PD-1的藥物、阻斷PD-1與PDL-1結合的藥物、激活T淋巴細胞的藥物、提高T淋巴細胞中IL-2、IFN-γ表達的藥物中套用。

實施方式

• 實施例1：VEGF與PD1蛋白的製備

1、PD-1抗原的表達載體構建

從南京金斯瑞公司合成人的PD-1的cDNA，GeneID為5133，cDNA ID為NM_005018.2。在合成的胞外區PD-1基因後加上Fc純化標籤，並在兩端引入XbaI，BamHI兩個限制性酶切位點連線到pTT5表達質粒，經測序驗證正確。測序完的質粒轉染Trans10（購自北京全式金生物技術有限公司），挑取單克隆，接種到1升LB液體培養基，至OD600為1時，離心收集菌體，用質粒大提試劑盒（購自Qiagen公司）提取質粒。

2、VEGF抗原的表達載體構建

對基因VEGF（NCBIGeneID:7422）所對應的胺基酸與小鼠IgG的Fc蛋白片段mFc（Iggamma-2AchainCregion）進行融合設計得到VEGF-mFc。為提高目的基因在293F細胞表達系統中的表達效率，將序列進行最佳化，並在兩端引入XbaI，BamHI兩個限制性酶切位點連線到pTT5表達質粒，經測序驗證正確。測序完的質粒轉染Trans10（購自北京全式金生物技術有限公司），挑取單克隆，接種到1升LB液體培養基，至OD600為1時，離心收集菌體，用質粒大提試劑盒（購自Qiagen公司）提取質粒。

3、PD-1和VEGF抗原的表達及純化

將測序鑑定正確的表達載體轉染293F細胞（購自Invitrogen公司），37度，5％CO₂，130轉/分鐘培養7天后，離心收集上清。將上清於4000轉離心10分鐘，再用0.45微米濾膜過濾；濾液加入400毫摩爾/升 NaCl；調整pH至8.0。樣品經0.2微米濾膜再次過濾後，上樣至已用PBS（137毫摩爾/升 NaCl，2.7毫摩爾/升 KCl，10毫摩爾/升 Na₂HPO₄，2毫摩爾/升 KH₂PO₄，pH7.4）平衡好的5毫升HiTrapProteinA柱；待樣品上完後用PBS沖洗，流速5毫升/分鐘，紫外監測為水平。BufferB（1MGlycine，pH3.5）洗脫，流速1毫升/分鐘，收集流出峰用Tris中和至pH7.5，並進行SDS-PAGE檢測，SDS-PAGE電泳結果如圖1所示。用超濾濃縮管濃縮洗脫峰換液至PBS中，由此得到抗原。

• 實施例2：雙功能抗體BsAb7和BsAb8蛋白的製備

1.雙功能抗體表達載體構建

人工合成抗體BsAb7的輕鏈的cDNA（其序列如SEQ ID NO.1所示），人工合成抗體BsAb7重鏈的cDNA（其序列如SEQ ID NO.3所示），人工合成抗體BsAb8重鏈的cDNA（其序列如SEQ ID NO.5所示），將合成的cDNA分別克隆到pTT5質粒中，並通過測序確定質粒構建正確。測序完的質粒轉染Trans10（購自北京全式金生物技術有限公司），挑取單克隆，接種到1升LB液體培養基，至OD600為1時，離心收集菌體，用質粒大提試劑盒（購自Qiagen公司）提取質粒。

2.雙功能抗體BsAb7和BsAb8蛋白表達與純化

將測序鑑定正確的BsAb7和BsAb8重鍊表達載體和輕鍊表達載體（1:1）共轉染到293F細胞中，37度，5％CO₂，130轉/分鐘培養7天后，離心收集上清。將上清4000轉離心10分鐘，並用0.45微米濾膜過濾，收集濾液；濾液加入400毫摩爾/升 NaCl；調整pH至8.0。樣品經0.2微米濾膜再次過濾後，上樣至已用PBS（137毫摩爾/升 NaCl，2.7毫摩爾/升KCl，10毫摩爾/升 Na₂HPO₄，2毫摩爾/升 KH₂PO₄，pH7.4）平衡好的5毫升HiTrapMabSelect柱（購自GE公司）；待樣品上完後用PBS沖洗，流速5毫升/分鐘，紫外監測為水平。BufferB（1MGlycine，pH3.5）洗脫，流速1毫升/分鐘，收集流出峰用Tris中和至pH7.5，並進行SDS-PAGE檢測，SDS-PAGE非還原電泳檢測結果見圖2。用超濾濃縮管濃縮洗脫峰，用脫鹽柱換液至PBS中，由此得到抗體BsAb7和BsAb8蛋白。

• 實施例3：雙功能抗體BsAb7和BsAb8對PD-1和VEGF親和力測定

通過Biacore3000儀器（購自GE公司）分析抗PD-1/VEGF抗體BsAbB7和BsAbB8的表征親和力及結合動力學。利用生物素標記試劑盒（Pierce公司）將重組融合蛋白與生物素共價偶聯，然後流過親和素標記的SA晶片（購自GE公司），使反應值RU達到450左右。通過將抗體以0.0133、0.0266、0.0532、0.1064、0.2128微米的濃度和50微升/分鐘的流速在PBS緩衝液中流動而測量結合。追蹤抗原-抗體結合動力學3分鐘並追蹤解離動力學10分鐘。使用BIAevaluation軟體將結合和解離曲線擬合至1:1朗格繆爾（Langmuir）結合模型。為了使親合力在評估結合常數時的作用最小化，僅使用對應於結合和解離期的起始數據段來進行擬合，測定的Kd、Kon和Koff值結果見表1。

表1雙功能抗體BsAb7和BsAb8對PD-1、VEGF親和常數（Kd）測定結果

表1

/	Kn（10Ms）	Koff（10s）	Kd（納米）
BsAb7-PD-1	1.02	2.42	0.24
BsAb8-PD-1	0.96	2.33	0.24
BsAb7-VEGF	1.44	2.10	0.15
BsAb8-VEGF	1.89	2.31	0.12

• 實施例4：競爭ELISA方法分別測定雙功能抗體BsAb7和BsAb8與PDL-1競爭結合抗原PD-1

用PD-1-mFc包被酶標板，1％BSA封閉，分別將不同濃度的抗體BsAb7和BsAb8與PDL-1-hFc混合，37℃孵育後加入酶標二抗37℃孵育30分鐘。在酶標儀上檢測450納米的吸光值（見表2）。雙功能抗體BsAb7和BsAb8與抗原PD-1結合結果顯示，雙功能抗體BsAb7和BsAb8均能有效地與PDL-1競爭結合PD-1蛋白，並且其結合效率呈劑量依賴關係。通過對結合的雙功能抗體BsAb7和BsAb8的競爭ELISA結果分析，曲線模擬雙功能抗體BsAb7和BsAb8的結合效率EC50分別為：2.5納米和2.9納米。

表2競爭ELISA測定雙功能抗體BsAb7和BsAb8阻斷PD-1/PDL-1結合能力結果

表2

抗體濃度	OD450（BsAb7）	OD450（BsAb8）
（原液）2微克/毫升	0.096	0.107
1:3	0.101	0.110
1:9	0.323	0.323
1:27	0.733	0.802
1:81	0.852	0.831
1:243	0.857	0.854
1:729	0.898	0.866
對照/0	0.901	0.899

• 實施例5：雙功能抗體BsAb7和BsAb8體外誘導T細胞分泌IL2

採用Ficoll離心法（購自GE公司）和CD4+T細胞富集柱（購自R&D Systems公司），製備新鮮的的PBMC，純化人T細胞。將細胞鋪板至96孔平底板中，培養過夜後，加入25納摩爾、5納摩爾、1納摩爾三種不同濃度雙功能抗體BsAb7和BsAb8及80ng/毫升的破傷風毒素（TT），加入25納摩爾、5納摩爾、1納摩爾三種濃度的同種型對照抗體作為陰性對照，培養3天后收集上清液，用Luminex儀（購自Life Technology公司）和細胞因子IL2檢測試劑盒（購自BDBiosciences公司）檢測上清IL2的分泌水平。結果如圖3所示，結果表明：雙功能抗體BsAb7和BsAb8均可有效刺激T細胞的功能，分泌IL2，且與抗體濃度有關，而同型對照抗體不能促進T細胞增殖和IL2分泌。

• 實施例6：雙功能抗體BsAb7和BsAb8體外誘導T細胞分泌IFN-γ

用Ficoll離心法（購自GE公司）和CD4+T細胞富集柱（購自R&D Systems公司），製備新鮮的的PBMC，純化人T細胞。使用Miltenyi CD14單核細胞純化試劑盒純化單核細胞，並在單核細胞與GM-CSF和IL-4（均購自Pepro Tech公司）一起培養7天后生成DC細胞。將細胞鋪板至96孔平底板中，培養過夜後，每份培養物在200μl的總體積中包含10e5個純化的T細胞和10e4個樹突細胞。加入25納摩爾、5納摩爾、1納摩爾三種不同濃度雙功能抗體BsAb7和BsAb8抗體，加入25納摩爾、5納摩爾、1納摩爾三種濃度的同種型對照抗體作為陰性對照。將細胞於37℃培養5天。5天后，從每份培養物中取出100μl培養基用於細胞因子IFN-γ測量。利用OptEIAELISA試劑盒（購自BD Biosciences公司）來測定IFN-γ的水平。結果（如圖4所示）顯示雙功能抗體BsAb7和BsAb8均可有效刺激T細胞的功能分泌細胞因子IFN-γ，且與濃度有關，而同型對照抗體不能促進T細胞增殖和IFN-γ分泌。

• 實施例7：雙功能抗體BsAb7和BsAb8抑制小鼠腫瘤生長

培養人Caki-1細胞，在細胞對數期收集細胞，做成濃度為（1.0×107）/毫升細胞懸液，取6-8周裸鼠，在裸鼠右前肢腋下注射1.0×106個（約0.1毫升）細胞懸液，10天左右腫瘤長至直徑約5mm，致瘤成功，隨機均分為4組：陰性對照組（腹腔注射生理鹽水組）、BsAb7組（尾靜脈注射3毫克/千克組）、BsAb8組（尾靜脈注射3毫克/千克）、陽性對照組貝伐珠單抗（尾靜脈注射2毫克/千克）。每3天給藥1次，連續給藥21天。21天后，處死裸鼠並稱瘤體重量，抑瘤率＝×100％。實驗結果如表3所示，BsAb7和BsAb8均能抑制小鼠腫瘤生長。

表3雙功能抗體BsAb7和BsAb8抑制小鼠腫瘤生長結果

組別	平均瘤重（克）	平均抑瘤率（％）
陰性對照	2.544±0.316	/
BsAb7	0.932±0.224	63.4
BsAb8	0.867±0.255	65.9
貝伐珠單抗	0.912±0.213	64.2

榮譽表彰

2020年7月17日，《一種抗VEGF-抗PD-1雙功能抗體及其套用》獲得安徽省第七屆專利獎優秀獎。