《一種單磷酸阿糖腺苷的製備方法》是海南中化聯合製藥工業股份有限公司於2015年6月10日申請的專利，該專利公布號為CN105039466A，公布日為2015年11月11日，發明人是魏雪紋。該發明涉及抗病毒藥物的製備技術領域。
《一種單磷酸阿糖腺苷的製備方法》以β-D-阿糖腺苷為起始原料，加入反應酶進行酶促合成反應，經過濾、析晶後既得所述單磷酸阿糖腺苷。具體包括以下步驟：1）配製反應液：在溫度為25℃~45℃的條件下，將去離子水、ATP.Na2、β-D-阿糖腺苷、甘油、鎂離子溶液攪拌得混合液，在混合液中加入鹼性溶液調節pH值至7.5~9.0，加入二硫蘇糖醇，既得所述反應液；2）酶促合成反應：在所述反應液中加入反應酶進行酶促合成反應，控制反應液的pH值為7.6~8.6，反應時間為24小時~72小時，完成酶促合成反應；3）過濾、析晶：將步驟2）中完成酶促合成反應的反應液冷卻，過濾得濾液，將濾液冷卻析晶，再過濾，既得所述單磷酸阿糖腺苷。該發明成本較低，產品易分離純化，純度高，對環境污染小。
2019年9月，《一種單磷酸阿糖腺苷的製備方法》獲得第二屆海南省專利獎優秀獎。
基本介紹
- 中文名：一種單磷酸阿糖腺苷的製備方法
- 公布號：CN105039466A
- 公布日：2015年11月11日
- 申請號：2015103132168
- 申請日：2015年6月10日
- 申請人：海南中化聯合製藥工業股份有限公司
- 地址：海南省海口市海口國家高新區藥谷工業園區藥谷三橫路2號
- 發明人：魏雪紋
- 分類號：C12P19/32(2006.01)I
- 類別：發明專利
專利背景,發明內容,專利目的,技術方案,改善效果,權利要求,實施方式,榮譽表彰,
專利背景
單磷酸阿糖腺苷（vidarabine monophosphate，Am-AMP）是β-D-阿糖腺苷（Ara-A）的單磷酸化合物，是一種人工合成的腺嘌呤核苷類抗病毒藥。截至2015年6月，在中國主要用於慢性病毒性肝炎、單純皰疹病毒、帶狀皰疹病毒、牛痘病毒以及多種動物皰疹病毒和少數致癌RNA病毒等。單磷酸阿糖腺苷已在歐洲、美國、日本等許多國家上市。由於單磷酸阿糖腺苷臨床用藥劑量很大，為滿足臨床用藥需要，適合工業化生產的單磷酸阿糖腺苷的合成工藝開發非常必要。2015年6月之前，已有的單磷酸阿糖腺苷的製備方法主要有化學法、生物轉化法以及基因工程法，化學法因研究開發技術比較成熟，市場上的單磷酸阿糖腺苷普遍採用化學法製備。 中國專利公布號CN103204890A公開了一種磷酸化製備單磷酸阿糖腺苷的方法，具體的說，以阿糖腺苷為起始原料，經惰性氣體保護在縛酸劑和催化劑的作用下經磷酸化後，通過活性炭脫色等後處理即得粗品單磷酸阿糖腺苷，此工藝路線簡單，成本低，收率高，相對於2015年6月之前的技術，生產過程毒性大大降低，適合工藝化生產。但是該方法使用惰性氣體保護，在縛酸劑和催化劑的作用下反應，反應後產生大量含有有機溶劑和三氯氧磷的廢液，三氯氧磷遇水蒸氣分解成磷酸與氯化氫，含磷可致磷中毒，對皮膚、黏膜有刺激腐蝕作用，毒性與光氣類似。短期內吸入大量蒸氣，可引起上呼吸道刺激症狀、咽喉炎、支氣管炎；嚴重者可發生喉頭水腫窒息、肺炎、肺水腫、紫紺、心力衰竭。亦可發生貧血、肝臟損害、蛋白尿，與眼和皮膚接觸引起灼傷。長期低濃度接觸可引起口、眼及呼吸道刺激症狀，對環境污染較大。 中國專利公布號CN104372050A公開了一種單磷酸阿糖腺苷的方法，通過先製備共表達嘌呤核苷磷酸化酶和尿苷磷酸化酶的基因工程菌，再利用該基因工程菌製備單磷酸阿糖腺苷的方法。於通過分子克隆的方法在基因工程菌中共同表達嘌呤核苷磷酸化酶和尿苷磷酸化酶，獲得具有高酶比活的阿糖腺苷生物轉化菌，套用該發明得到的菌體生產阿糖腺苷，將得到的阿糖腺苷經惰性氣體保護在縛酸劑、催化劑的作用下經磷酸化後，處理即得單磷酸阿糖腺苷。最終還是將得到的阿糖腺苷經惰性氣體保護在縛酸劑、催化劑的作用下經磷酸化後，處理即得單磷酸阿糖腺苷，該方法與中國專利公布號CN103204890A一樣存在著相同的問題。
因此，亟需提供一種構思不同的單磷酸阿糖腺苷的製備方法，以解決上述問題。
發明內容
專利目的
該發明提供了一種單磷酸阿糖腺苷的製備方法，解決了2015年6月之前技術中製備單磷酸阿糖腺苷的過程對環境污染較大的技術問題。
技術方案
《一種單磷酸阿糖腺苷的製備方法》以β-D-阿糖腺苷為起始原料，加入反應酶進行酶促合成反應，經析晶、過濾後既得所述單磷酸阿糖腺苷。
具體地，包括如下步驟：
1）配製反應液：在溫度為25℃~45℃的條件下，將ATP.Na2、β-D-阿糖腺苷、甘油、鎂離子溶液攪拌得混合液，所述ATP.Na2、β-D-阿糖腺苷、鎂離子溶液的摩爾質量比為1:1~5:10~15:0.05~0.2，在混合液中調節pH值至7.5~9.0，加入二硫蘇糖醇既得所述反應液。 2）酶促合成反應：在所述反應液中加入濃度為10~10毫摩爾/升反應酶進行酶促合成反應，加入鹼性溶液控制反應液的pH值為7.6~8.6，反應時間為24小時~72小時，完成酶促合成反應。
3）過濾析晶：將步驟2）中完成酶促合成反應的反應液冷卻至15℃~24℃，過濾得濾液，將所述濾液冷卻至-2℃~14℃析晶，再過濾，乾燥，既得所述單磷酸阿糖腺苷。
其化學反應式如下：
優選地，在步驟2）中，反應液的pH值不再變化時取樣做HPLC分析，當β-D-阿糖腺苷含量小於3%時，完成酶促合成反應。
優選地，在步驟2）中，所述合成酶為肌酸激酶、磷酸激酶、腺苷激酶的一種。
優選地，在步驟2）中，在反應時間為24小時後，每間隔6小時~10小時取樣做HPLC分析，當β-D-阿糖腺苷含量小於3%時，完成酶促合成反應。
優選地，在步驟3）中，所述過濾為通過粗蛋白膜過濾。
改善效果
採用該發明所提供的一種單磷酸阿糖腺苷的製備方法，相對於2015年6月之前採用化學有機溶劑製備單磷酸阿糖腺苷的方法，其成本較低，產品易分離純化，產品純度高，對環境污染小。
權利要求
1.《一種單磷酸阿糖腺苷的製備方法》其特徵在於，以β-D-阿糖腺苷為起始原料，加入反應酶進行酶促合成反應，經過濾、析晶後既得所述單磷酸阿糖腺苷；
其中，具體包括以下步驟：
1） 配製反應液：在溫度為25℃-45℃的條件下，將ATP.Na2、β-D-阿糖腺苷、甘油、鎂離子溶液攪拌得混合液，所述ATP.Na2、β-D-阿糖腺苷、甘油、鎂離子溶液的摩爾質量比為1:1-5:10-15:0.05-0.2，在混合液中加入調節pH值至7.5-9.0，加入二硫蘇糖醇既得所述反應液；
2） 酶促合成反應：在所述反應液中加入反應酶使其濃度為10-10毫摩爾/升，進行酶促合成反應，加入鹼性溶液控制反應液的pH值為7.6-8.6，反應時間為24小時-72小時，完成酶促合成反應；
3） 過濾、析晶：將步驟2）中完成酶促合成反應的反應液冷卻至15℃-24℃，過濾得濾液，將所述濾液冷卻至-2℃-14℃析晶，再過濾，既得所述單磷酸阿糖腺苷；其中，在步驟2）中，所述反應酶為肌酸激酶、腺苷激酶的一種。
2.如權利要求1所述的一種單磷酸阿糖腺苷的製備方法，其特徵在於，在步驟2）中，反應液的pH值不再變化時取樣做HPLC分析，當β-D-阿糖腺苷含量小於3%時，完成酶促合成反應。
3.如權利要求1所述的一種單磷酸阿糖腺苷的製備方法，其特徵在於，在步驟1）中，所述鎂離子溶液為醋酸鎂、硫酸鎂、氯化鎂的一種。
4.如權利要求1所述的一種單磷酸阿糖腺苷的製備方法，其特徵在於，在步驟2）中，在反應時間為24小時後，每間隔6小時-10小時取樣做HPLC分析，當β-D-阿糖腺苷含量小於3%時，完成酶促合成反應。
5.如權利要求2所述的一種單磷酸阿糖腺苷的製備方法，其特徵在於，在步驟3）中，所述過濾為通過粗蛋白膜過濾。
6.如權利要求2所述的一種單磷酸阿糖腺苷的製備方法，其特徵在於，在步驟1）中，所述鹼性溶液為氫氧化鈉溶液、濃氨水、碳酸氫鈉溶液、碳酸鈉溶液。
實施方式
- 實施例1
《一種單磷酸阿糖腺苷的製備方法》包括以下步驟：
1）配製反應液：向2升錐形瓶中分別加入700毫升去離子水、1.1摩爾甘油、0.4毫升TritonX-100、0.007摩爾硫酸鎂和0.1摩爾的ATP.Na2，然後攪拌下用10NNaOH（約15毫升~20毫升）調節溶液的pH值至7.5±0.1；向以上溶液中加124毫克二硫蘇糖醇並攪拌溶解，補加去離子水至總體積800毫升；加入0.1摩爾Ara-A，攪拌均勻後通過水浴加熱至內溫達到27℃±2℃。
2）酶促合成反應：溶液加入肌酸激酶，使其濃度為1.0×10毫摩爾/升，水浴加熱保溫27℃±2℃並開始計時反應；反應期間需要及時檢測溶液的pH值，當pH值至7.2±0.3是向溶液中緩慢加入氨水使pH值恢復至7.5±0.1；保溫反應時間36小時以後每間隔10小時取樣HPLC分析，當Ara-A≤3%時反應結束。
3）過濾析晶：1、析晶：反應完成後將溶液冷卻至15℃，然後通過粗蛋白膜過濾；濾液冷卻至10℃；大量固體析出後降溫至0℃，保溫攪拌5小時後過濾。2、溶解：攪拌狀態下，400毫升0.25NNaOH溶液中分批加入固體，加入期間溶液溫度控制在10℃；全部加完後繼續攪拌50分鐘後測pH值，加入10NNaOH使最終pH值達到6.0±0.1。3、析晶：保溫在10℃的條件下，加入6NHCl使溶液pH值達到1.8±0.05；然後降溫至0℃並保溫攪拌5小時後析晶結束。4、過濾、乾燥：抽濾至無明顯流出液，然後用20升0.01NHCl水溶液淋洗，濕品在50℃鼓風乾燥5小時後，既得成品單磷酸阿糖腺苷，收率為77.15%，純度為99.6%。
- 實施例2
一種單磷酸阿糖腺苷的製備方法，包括以下步驟：
1）配製反應液：向2000升反應釜中分別加入700升去離子水、1100摩爾甘油、0.4升TritonX-100、9.03摩爾氯化鎂和100摩爾ATP.Na2；然後攪拌下用10NNaOH（約15-20升）調節溶液的pH值至9.0±0.1；溶液中加124克二硫蘇糖醇和分批加入100摩爾Ara-A，加入期間攪拌速度至60赫茲，攪拌均勻後再次檢測pH值並可用氨水調節pH值至9.0±0.1，控制反應溫度為32℃±2℃。
2）酶促合成反應：攪拌速度降至35赫茲，向以上溶液中加入肌酸激酶，使其濃度為1.0×10毫摩爾/升，反應釜密閉狀態下保溫32℃±2℃開始計時反應；反應期間及時檢測溶液pH值，當pH值至7.2±0.3時是向溶液中緩慢加入氨水使pH值恢復至9.0±0.1；檢測溶液pH值為反應前6小時內每60分鐘檢測一次，4小時~24小時內每1小時~2小時檢測一次，24小時以後每3~5小時檢測一次。保溫反應時間72小時以後每6小時取樣HPLC分析，當Ara-A≤1%時反應結束。
3）過濾析晶：反應完成後將溶液冷至18℃，然後通過粗蛋白膜過濾；濾液進入3000升反應釜，並冷卻至5℃；保溫子5℃的條件下，加入6NHCl使溶液pH值達到1.2±0.1。控制溶液溫度為5℃的條件下，加入Ara-AMP晶種85克，然後保溫攪拌至大量固體析出後降溫至0℃，保溫攪拌5小時後每隔2小時測上清OD，至兩次相差小於3%後溶液溫度降至-2℃±1℃，然後保溫攪拌5小時；離心至無明顯流出液，然後用25升0.01NHCl水溶液淋洗，再離心2小時後取出固體。
4）重結晶：1、溶解：攪拌狀態下，400升0.25NNaOH溶液中分批加入固體，加入期間溶液溫度控制在15℃；全部加完後繼續攪拌60分鐘後測pH值，加入10NNaOH使最終使pH值達到6.0±0.1。2、過濾：溶液經過高壓超濾後進入1000升結晶釜並用不超過50升的去離子水淋洗設備和超濾膜。3、析晶：待結晶液測OD260納米，用去離子水稀釋至1650-1700個OD/毫升；保持溫度為15℃，加入6NHCl使溶液pH達到1.8±0.05；然後降溫至2℃並保溫攪拌5小時後每隔2小時測上清OD260納米：當≤原液8%時析晶結束。4、離心：離心至無明顯流出液，然後用23升0.01NHCl水溶液淋洗，再離心1小時後取出固體；進入鼓風乾燥箱後設定溫度38℃並開始鼓風乾燥，至K.F<8%時結束；既得成品單磷酸阿糖腺苷，收率為75.14%，純度為99.5%。實施例3
一種單磷酸阿糖腺苷的製備方法，包括如下步驟：
1）配製反應液：向2升錐形瓶中分別加入700毫升去離子水、1.5摩爾的甘油、0.4毫升TritonX-100、0.02摩爾的四水醋酸鎂和0.1摩爾的ATP.Na2，然後攪拌下用10NNaOH（約15毫升~20毫升）調節溶液的pH值至8.3±0.1；向以上溶液中加124毫克二硫蘇糖醇並攪拌溶解，補加去離子水至總體積800毫升；加入0.4摩爾的Ara-A，攪拌均勻後通過水浴加熱至內溫達到43℃±2℃。
2）酶促合成反應：溶液加入磷酸激酶，使其濃度為1.0×10毫摩爾/升，水浴加熱保溫43℃±2℃並開始計時反應；反應期間需要及時檢測溶液的pH值，當pH值至7.2±0.3時，向溶液中緩慢加入氨水使pH值恢復至8.3±0.1；保溫反應時間24小時以後每間隔8小時取樣HPLC分析，當Ara-A≤3%時反應結束。
3）過濾析晶：1、析晶：反應完成後將溶液冷卻至20℃，然後通過粗蛋白膜過濾；濾液冷卻至14℃；大量固體析出後降溫至2℃，保溫攪拌5小時後過濾。2、溶解：攪拌狀態下，400毫升0.25NNaOH溶液中分批加入固體，加入期間溶液溫度控制在14℃；全部加完後繼續攪拌55分鐘後測pH值，加入10NNaOH使最終pH值達到6.0±0.1。3、析晶：保溫在14℃的條件下，加入6NHCl使溶液pH值達到1.8±0.05；然後降溫至2℃並保溫攪拌5小時後析晶結束。4、過濾、乾燥：抽濾至無明顯流出液，然後用22升0.01NHCl水溶液淋洗，濕品在50℃鼓風乾燥5小時後，既得成品單磷酸阿糖腺苷，收率為78.38%，純度為99.1%。
- 實施例4
一種單磷酸阿糖腺苷的製備方法，包括如下步驟：
1）配製反應液：向2升錐形瓶中分別加入800毫升去離子水、1.2摩爾的甘油、0.5毫升
TritonX-100、0.0089摩爾的四水醋酸鎂和0.1摩爾的ATP.Na2，然後攪拌下用10NNaOH（約15毫升~20毫升）調節溶液的pH值至8.3±0.1；向以上溶液中加124毫克二硫蘇糖醇並攪拌溶解，補加去離子水至總體積800毫升；加入0.1摩爾的Ara-A，攪拌均勻後通過水浴加熱至內溫達到38℃±2℃。
2）酶促合成反應：溶液加入腺苷激酶，使其濃度為1.0×10毫摩爾/升，水浴加熱保溫38℃±2℃並開始計時反應；反應期間需要及時檢測溶液的pH值，當pH值至7.2±0.3時，向溶液中緩慢加入氨水使pH值恢復至8.3±0.1；保溫反應時間24小時以後每間隔8小時取樣HPLC分析，當Ara-A≤3%時反應結束。
3）過濾析晶：1、析晶：反應完成後將溶液冷卻至20℃，然後通過粗蛋白膜過濾；濾液冷卻至14℃；大量固體析出後降溫至2℃，保溫攪拌5小時後過濾。2、溶解：攪拌狀態下，400毫升0.25NNaOH溶液中分批加入固體，加入期間溶液溫度控制在14℃；全部加完後繼續攪拌55分鐘後測pH值，加入10NNaOH使最終pH值達到6.0±0.1。3、析晶：保溫在14℃的條件下，加入6NHCl使溶液pH值達到1.8±0.05；然後降溫至2℃並保溫攪拌5小時後析晶結束。4、過濾、乾燥：抽濾至無明顯流出液，然後用24升0.01NHCl水溶液淋洗，濕品在55℃鼓風乾燥5小時後，既得成品單磷酸阿糖腺苷，收率為78.73%，純度為99.5%。
在實施例中反應酶均採用了肌酸激酶，肌酸激酶在哺乳動物肌肉細胞漿中的含量很高，可以從動物肌肉提取的肌酸激酶。腺苷激酶和磷酸激酶均屬於核苷激酶，存在於肝臟、腎臟、酵母等。以三磷酸腺苷二鈉（ATP.Na2）和β-D-阿糖腺苷在最適合酶反應條件下生產單磷酸阿糖腺苷的過程，提高了產品的純度，對反應的控制和產品純化更為有利。 在生產過程中使用了監控pH值的方法來監控反應過程，用HPLC的方法檢測反應終點，酶在反應過程中不斷地釋放H，我們利用酶反應過程中pH值的變化來監測反應，通過滴加稀鹼液來保持酶反應在恆定的鹼性條件下進行。用HPLC檢測β-D-阿糖腺苷的含量可以判斷反應是否完成及完成的程度，從而使得所製備的單磷酸阿糖腺苷在純度上更優越。 更重要的是，使用酶法製備單磷酸阿糖腺苷，反應過程中不採用有機溶劑，避免了反應中化學試劑尤其是三氯氧磷而造成對環境污染的問題，實現反應綠色環保無污染，具有顯著的進步。
榮譽表彰
2019年9月，《一種單磷酸阿糖腺苷的製備方法》獲得第二屆海南省專利獎優秀獎。
