《一株高效底改芽孢桿菌及其製成的複合底改菌劑和套用》是江南大學、泰州綠聖元生物科技有限公司、江蘇大有生物科技發展有限公司於2014年6月3日申請的發明專利，該專利申請號為2014102417828，公布號為CN104017757A，公布日為2014年9月3日，發明人是張梁、石孔泉、唐旭彪。
《一株高效底改芽孢桿菌及其製成的複合底改菌劑和套用》的發明人提供了一株特基拉芽孢桿菌（Bacillus tequilensis）ZSGD5，保藏編號為CCTCCNO：M 2014004，保藏日期為2014年1月6日，保藏地點為中國典型培養物保藏中心（中國，武漢，武漢大學）；該發明人還提供了一種複合微生態芽孢桿菌製劑，由以下菌種組成複合菌劑：特基拉芽孢桿菌、第一類枯草芽孢桿菌、第二類枯草芽孢桿菌、第一類地衣芽孢桿菌、第二類地衣芽孢桿菌、短小芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌。該發明所提供的特基拉芽孢桿菌具有高效水體底部淨化能力，能快速分解和降低池底污泥，有效改善環境水體的黑水、渾水現象，可以用於水產養殖的水體環境處理和城市廢水治理中。
2021年6月24日，《一株高效底改芽孢桿菌及其製成的複合底改菌劑和套用》獲得第二十二屆中國專利優秀獎。
基本介紹
- 中文名：一株高效底改芽孢桿菌及其製成的複合底改菌劑和套用
- 申請人：江南大學、泰州綠聖元生物科技有限公司、江蘇大有生物科技發展有限公司
- 發明人：張梁、石孔泉、唐旭彪
- 申請號：2014102417828
- 申請日：2014年6月3日
- 公布號：CN104017757A
- 公布日：2014年9月3日
- 地址：江蘇省無錫市濱湖區蠡湖大道1800號
- 代理機構：無錫華源專利事務所（普通合夥）
- 代理人：聶漢欽
- Int. Cl.：C12N1/20、C02F3/34、C12R1/07、C12R1/125、C12R1/10、C12R1/11
- 類別：發明專利
專利背景,發明內容,專利目的,技術方案,改善效果,技術領域,權利要求,實施方式,操作內容,檢測案例,專利榮譽,
專利背景
利用微生態製劑進行水質處理或改良，維護良好生態環境，是21世紀生物工程技術與實際套用有效結合的一個典型。但由於各種微生物的效用差別較大，如何用最有效和最少量的微生物來達到優異的處理效果，是各科研機構、學校和企業進行不斷研究和開發的方向。
截至2014年6月，水產養殖中的殘餘餌料以及養殖對象的排泄物對養殖環境造成嚴重影響，許多城市的河道，也因為人類的生活垃圾污水排放，導致河道有機質富集，最終造成河水發黑等現象。利用各種不同功效微生物的自身特性，開發有效的微生物種群組合來對養殖水體以及城市河道中的多餘有機質進行處理，對於水質改良和處理，具有十分積極的意義。
發明內容
專利目的
《一株高效底改芽孢桿菌及其製成的複合底改菌劑和套用》的目的是提供一株高效底改芽孢桿菌及其製成的複合底改菌劑和套用，所提供的特基拉芽孢桿菌具有高效水體底部淨化能力，能快速分解和降低池底污泥，有效改善環境水體的黑水、渾水現象，可以用於水產養殖的水體環境處理和城市廢水治理中。
技術方案
《一株高效底改芽孢桿菌及其製成的複合底改菌劑和套用》提供了一株特基拉芽孢桿菌（Bacillus tequilensis）ZSGD5，保藏編號為CCTCCNO：M2014004，保藏日期為2014年1月6日，保藏地點為中國典型培養物保藏中心，中國，武漢，武漢大學。
《一株高效底改芽孢桿菌及其製成的複合底改菌劑和套用》提供了一種複合微生態芽孢桿菌製劑，由以下菌種組成複合菌劑：
所述特基拉芽孢桿菌的保藏編號為CCTCCNO：M 2014004、第一類枯草芽孢桿菌的保藏編號為CCCTCNO：M 2011443、第一類地衣芽孢桿菌的保藏編號為CCTCCNO：M 2012458，保藏地點均為中國典型培養物保藏中心；其餘菌種為市售產品。
所述複合微生態芽孢桿菌製劑的有效活菌數為5.0×10～2.0×10cfu/克，使用量為每畝使用20-100克，各菌種的組成如下：
菌種 | 每克產品對應菌種活菌數，單位為cfu/克 |
|---|---|
特基拉芽孢桿菌 | 1.0×10～5.0×10 |
第一類枯草芽孢桿菌 | 1.0×10～5.0×10 |
第二類枯草芽孢桿菌 | 1.0×10～5.0×10 |
第一類地衣芽孢桿菌 | 5.0×10～1.0×10 |
第二類地衣芽孢桿菌 | 0.8×10～5.0×10 |
短小芽孢桿菌 | 0.2×10～1.0×10 |
巨大芽孢桿菌 | 5.0×10～1.0×10 |
總活菌數 | 5.0×10～2×10 |
《一株高效底改芽孢桿菌及其製成的複合底改菌劑和套用》提供了一種複合微生態芽孢桿菌製劑的套用，用於水產養殖對象的池底水質底改中，可以有效控制養殖水體中餌料殘渣以及養殖對象排泄物造成的污染，保持溶氧的增長、抑制池底青苔，降低氨氮、亞硝酸鹽、硫化氫的量。
《一株高效底改芽孢桿菌及其製成的複合底改菌劑和套用》提供了一種複合微生態芽孢桿菌製劑的套用，用於城市河道黑水、渾水的治理中，可以改善河道死黑水的狀態，降低河道的河水COD為40%。
特基拉芽孢桿菌的主要生物學特徵為：革蘭氏陽性細菌，桿狀，大小0.7-0.8微米×2-3微米，無莢膜，有鞭毛，能運動。
特基拉芽孢桿菌菌株的來源為水產養殖池塘的底泥，篩選方法為：將從水產養殖池塘中取得的底泥加入無菌生理鹽水，在37攝氏度搖床上120轉/分鐘條件下振盪20分鐘，吸取上清液，加入其他污染河流底泥為基質的液體中，振盪6小時，將富集液稀釋10000倍後，用塗布棒塗布到該污染河流底泥為唯一基質的固體平板中，在37攝氏度恆溫培養箱中培養40~48小時，得到在平板上生長的菌株，擴培後進行篩選。
特基拉芽孢桿菌菌株的培養方法為：
（1）種子培養基配方：蛋白腖10克/升，氯化鈉10克/升，酵母粉5克/升，用蒸餾水配製，全部溶解後調節pH7.5~7.6，固體培養基在調節pH後在往培養基中添加15克/升瓊脂粉，上述配製好的溶液在121攝氏度下滅菌20分鐘。
（2）從平板上挑取1環芽孢桿菌移入滅菌的試管固體斜面培養基中，37攝氏度培養18~24小時。
（3）將上述長好的菌株斜面在95~100攝氏度水浴中熱處理5~10分鐘，取出迅速冷卻至室溫，挑取1環接種於裝有50毫升液體培養基的500毫升三角瓶中，在37攝氏度下搖床150轉/分鐘培養18~24小時，得到的菌液中活菌數為1×10~3×10個/毫升。
（4）該菌株能在以硝酸鹽或亞硝酸鹽為單一氮源的培養基中良好生長，單一硝化培養基為：葡萄糖20克/升，硝酸鈉2克/升（或者亞硝酸鈉2克/升），磷酸二氫鉀2克/升，硫酸鎂0.5克/升，pH6.0~6.2。
特基拉芽孢桿菌菌株的擴大培養方法為：擴大培養基配方：葡萄糖20克/升，酵母粉10克/升，蛋白腖15克/升，磷酸二氫鉀5克/升，硫酸鎂1克/升，pH7.0。擴大培養方法：在液體發酵罐中進行液體發酵，過程維持通氣量1:2立方米/（立方米·分鐘），攪拌200轉/分鐘，壓力1千克/平方米，用NaOH或者HCl溶液控制過程pH6.0。
在上述條件下培養24~48小時後，可以得到菌種的芽孢體，芽孢占活菌總數的95%以上，發酵液中的總芽孢數可以達到1×10~5×10cfu/毫升。發酵液經過離心、板框過濾等手段收集菌體，再將菌體經過噴霧乾燥即可獲得所需的芽孢。將獲得的芽孢體菌種，用作配製該發明中複合底改菌劑的菌種原料。
改善效果
《一株高效底改芽孢桿菌及其製成的複合底改菌劑和套用》所製備的微生態複合菌劑，經過高溫造粒，仍然能保持內部添加菌種的高效性，在不同的養殖水體和城市河道來源水體的試驗中，該複合微生態菌劑菌表現出了良好的功效性，以及內部添加微生物菌劑的高存活性。
《一株高效底改芽孢桿菌及其製成的複合底改菌劑和套用》所製備的微生態製劑菌種，能迅速分解處理對象水體底部的有機質（養殖水體的餌料、糞便等）使其徹底轉化，去除底部臭味；防止池底發黑、發臭；控制池中的硫化氧、氨氮等有毒有害物質；預防黃泥水、醬油水的發生、紅水、濃水、濁水，對青苔、藍藻等有害藻類的生長有明顯的抑制作用，使對象水體維持良好的生態環境。
技術領域
《一株高效底改芽孢桿菌及其製成的複合底改菌劑和套用》涉及工業生物技術領域，尤其是涉及一種特基拉芽孢桿菌以及由其製備而成的複合菌劑在水產養殖及廢水治理中的套用。
權利要求
1.一種複合微生態芽孢桿菌製劑，其特徵在於由以下菌種組成複合菌劑：特基拉芽孢桿菌、第一類枯草芽孢桿菌、第二類枯草芽孢桿菌、第一類地衣芽孢桿菌、第二類地衣芽孢桿菌、短小芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌；所述特基拉芽孢桿菌為特基拉芽孢桿菌（Bacillus tequilensis）ZSGD5，保藏編號為CCTCCNO：M 2014004，保藏日期為2014年1月6日，保藏地點為中國典型培養物保藏中心，中國，武漢，武漢大學；第一類枯草芽孢桿菌的保藏編號為CCTCCNO：M 2011443、第一類地衣芽孢桿菌的保藏編號為CCTCCNO：M 2012458，保藏地點均為中國典型培養物保藏中心；其餘菌種為市售產品。
2.根據權利要求1所述的複合微生態芽孢桿菌製劑，其特徵在於所述複合微生態芽孢桿菌製劑的有效活菌數為5.0×10～2.0×10cfu/克，使用量為每畝使用20-100克，各菌種的組成如下：
菌種 | 每克產品對應菌種活菌數，單位為cfu/克 |
|---|---|
特基拉芽孢桿菌 | 1.0×10～5.0×10 |
第一類枯草芽孢桿菌 | 1.0×10～5.0×10 |
第二類枯草芽孢桿菌 | 1.0×10～5.0×10 |
第一類地衣芽孢桿菌 | 5.0×10～1.0×10 |
第二類地衣芽孢桿菌 | 0.8×10～5.0×10 |
短小芽孢桿菌 | 0.2×10～1.0×10 |
巨大芽孢桿菌 | 5.0×10～1.0×10 |
總活菌數 | 5.0×10～2×10 |
3.一種權利要求1所述的複合微生態芽孢桿菌製劑的套用，其特徵在於用於水產養殖對象的池底水質底改中。
4.根據權利要求3所述的套用，其特徵在於所述的複合微生態芽孢桿菌製劑可以有效控制養殖水體中餌料殘渣以及養殖對象排泄物造成的污染，保持溶氧的增長、抑制池底青苔，降低氨氮、亞硝酸鹽、硫化氫的量。
5.一種權利要求1所述的複合微生態芽孢桿菌製劑的套用，其特徵在於在用於城市河道黑水、渾水的治理中。
6.根據權利要求5所述的套用，其特徵在於所述的複合微生態芽孢桿菌製劑可以改善河道死黑水的狀態，降低河道的河水COD為40%。
實施方式
操作內容
1、高效底改菌種的篩選
從水產養殖池塘的底泥及水體中分離得到適合水質改良的微生物菌株，通過對菌株進行形態學觀察、生理生化實驗、16SrDNA分析等手段有效而準確的確定菌種的屬種。
將從江蘇泰州姜堰某螃蟹養殖池塘中取得的底泥樣品稱取2克，加入98毫升無菌生理鹽水，在37攝氏度搖床上120轉/分鐘條件下振盪20分鐘，吸取上清液1毫升加入取自無錫市某污染河底泥為基質的液體中，振盪6小時，將富集液稀釋10000倍後，用塗布棒塗布到該河流底泥為唯一基質的固體平板中，在37攝氏度恆溫培養箱中培養40~48小時，得到三株在平板上生長的菌株，編號為ZSGD-1，ZSGD-5，ZSGD-9，並挑取單菌落進行擴陪，後利用擴陪得到的菌體進行污染河水的處理測試試驗，挑選出效果較好的其中一株菌種ZSGD-5，經過16SrDNA及生理生化性能的鑑定和測試，該菌種屬於特基拉芽孢桿菌，該芽孢桿菌能在低氧濃度下快速生長消耗污染水體的營養物質。
n-1的分類命名為特基拉芽孢桿菌（Bacillu stequilensis），於2014年1月6日保藏於中國典型培養物保藏中心，保藏編號為CCTCC M 2014004。
2、菌株擴大培養及產品收集
按照前面所述菌株的培養和擴大培養方法，將斜面的特基拉芽孢桿菌CCTCC M 2014004進行擴培，得到一定濃度的枯草芽孢桿菌的孢子液，再將其經過離心和噴霧乾燥等手段，得到芽孢粉劑產品。
3、複合底改菌劑（即複合微生態芽孢桿菌製劑）製作方法
將篩選到的特基拉芽孢桿菌以及其它有效菌株按照各自固體菌粉的活菌數配比比例混合，其中各個有效菌株固體菌粉的活菌添加比例（按照占產品的總活菌數計算）如下：
菌種 | 每克產品對應菌種活菌數，單位為cfu/克 |
|---|---|
特基拉芽孢桿菌（CCCTC M 2014004） | 1.0×10 |
第一類枯草芽孢桿菌（CCCTC M 2011443） | 1.0×10 |
第二類枯草芽孢桿菌 | 1.0×10 |
第一類地衣芽孢桿菌（CCTCC M 2012458） | 1.0×10 |
第二類地衣芽孢桿菌 | 0.8×10 |
短小芽孢桿菌 | 0.2×10 |
巨大芽孢桿菌 | 1.0×10 |
總活菌數 | 5.0×10 |
上述保藏編號均為中國典型培養物保藏中心保藏，而第二類枯草芽孢桿菌、第二類地衣芽孢桿菌、短小芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌均是由泰州綠聖元生物科技有限公司提供。
上述各菌粉按照既定比例混合均勻後，添載入體（麩皮粉、葡萄糖、玉米粉、米糠粉，沸石粉、硅藻土，活性炭、絹雲母粉）中的一種或者幾種補充到總重量的100%（以芽孢桿菌作為有效成分，加入載體使產品總重量滿足最終的活菌數達到5.0×10cfu/克），並進行造粒，得到菌劑顆粒，然後投入使用。
各個有效單菌粉按照上述方法嚴格配製，即可得到該發明所述的複合微生物底改菌劑，又稱為複合微生態芽孢桿菌製劑。該產品用於對各種有機質污染水體進行有效底改，使底泥從黑變黃，可以降低養殖水體池底殘餌、糞便，有效去除池底的氨氮、亞硝酸鹽、硫化氫等物質。
上述整個加工過程應保證操作環境的清潔，避免污染。控制環境濕度在70%以下，各原料水分含量低於15%，該產品製成後常溫下保存18個月，-18攝氏度下保存期限可以達到36個月，保質期內活菌數穩定。
檢測案例
檢測例1：複合微生態芽孢桿菌製劑用於鯽魚養殖水體的改性。
水樣取樣：蘇州太倉某養殖池塘，離岸1.5米，水面下30厘米水樣，按照《海洋監測規範》進行處理。測試時養殖水溫為22-27攝氏度，對照池為不添加該複合底改菌劑的結果。每畝·米池塘中撒入500克菌劑顆粒，處理結果如表1所示。
含量（百萬分比濃度） | 項目 | 處理前 | 處理2天后 | 處理3天后 | 處理4天后 |
|---|---|---|---|---|---|
氨氮 | 對照池 | 2.4 | 2.3 | 2.3 | 2.4 |
試驗池 | 2.5 | 1.9 | 0.08 | 0.07 | |
亞硝酸鹽 | 對照池 | 0.15 | 0.13 | 0.16 | 0.15 |
試驗池 | 0.14 | 0.09 | 0.07 | 0.06 | |
總無機氮 | 對照池 | 0.249 | 0.252 | 0.247 | 0.253 |
試驗池 | 0.241 | 0.185 | 0.102 | 0.103 | |
溶解氧 | 對照池 | 3.2 | 3.1 | 3.4 | 3.6 |
試驗池 | 3.1 | 3.5 | 4.5 | 5.2 | |
磷酸鹽 | 對照池 | 0.065 | 0.093 | 0.087 | 0.087 |
試驗池 | 0.067 | 0.043 | 0.038 | 0.029 |
從表1的數據可以看到，使用該複合菌劑，可以有效降低水體的氨氮、亞硝酸鹽、總無機氮、磷酸鹽，同時增加水體溶解氧含量。
檢測例2：複合微生態芽孢桿菌製劑用於河道黑水處理。
取自無錫某河道不同位置的污染水體2份，分別使用該菌劑進行處理試驗，對照組為不進行處理，試驗規模為5升，按照國標檢測COD。按照重量每畝·米水體加入500克菌劑顆粒，處理結果如表2所示。
項目 | 樣品1 | 樣品2 | ||
|---|---|---|---|---|
組別 | 試驗組 | 對照組 | 試驗組 | 對照組 |
處理前COD（百萬分比濃度） | 7371 | 7371 | 6738 | 6738 |
處理2天COD（百萬分比濃度） | 5321 | 7209 | 4796 | 6812 |
COD消耗比 | 27.81% | 2.20% | 28.82% | -1.10% |
處理4天COD（百萬分比濃度） | 4587 | 7305 | 4023 | 6619 |
COD消耗比 | 37.77% | 0.89% | 40.29% | 1.76% |
處理6天COD（百萬分比濃度） | 4376 | 7408 | 3851 | 6733 |
COD消耗比 | 40.63% | -5.02% | 42.85% | 0.07% |
從表2的數據可以看到，使用該菌劑處理河道污水，可以有效降低河道污水的COD。
專利榮譽
2021年6月24日，《一株高效底改芽孢桿菌及其製成的複合底改菌劑和套用》獲得第二十二屆中國專利優秀獎。
