《β-D-葡萄糖醛酸苷酶的糖基化及其催化識別研究》是依託北京理工大學，由李春擔任項目負責人的面上項目。
基本介紹
- 中文名：β-D-葡萄糖醛酸苷酶的糖基化及其催化識別研究
- 依託單位：北京理工大學
- 項目負責人：李春
- 項目類別：面上項目
項目摘要,結題摘要,
項目摘要
以β-D-葡萄糖醛酸苷酶為對象，構建大腸桿菌（E.coli，無糖基化）、畢赤巴斯德酵母（P. pastoris，高甘露糖型糖基化）、中國倉鼠卵巢細胞（CHO，複雜型糖基化）和野生產紫青黴（P.purpurogenum. Li-3，自然進化型糖基化）等四種不同水平的酶糖基化表達系統。研究四種不同表達系統所表達的β-D-葡萄糖醛酸苷酶的酶學性質及催化反應動力學。通過確定β-D-葡萄糖醛酸苷酶在不同表達系統中的糖基化位點、種類及程度，並分析和計算酶糖基化後的構象及其摺疊熱力學參數，探討不同糖基化方式及程度對酶分子結構、酶學特性的影響，闡明酶的糖基化與其催化識別的分子機理與基本規律，進而為酶分子的定向改造提供新思路和新方法。
結題摘要
以三種不同糖基化類型表達系統（產紫青黴P. purpurogenum Li-3自然進化糖基化型、大腸桿菌無糖基化型和畢赤巴斯德酵母高甘露糖糖基化型）表達的β-葡萄糖醛酸苷酶為對象，對三種酶進行分離純化；確定該酶在不同表達系統中的糖基化水平；研究不同糖基化水平的酶學性質及催化反應動力學；分析和計算糖基化後酶的構象穩定性及熱力學參數，探討糖基化對酶催化特性和結構的影響，嘗試將β-葡萄糖醛酸苷酶基因在中國倉鼠卵巢細胞（CHO）中表達，最後完成了在不同反應介質中的催化與轉化GAMG的研究。主要結論如下：1、 純化到產紫青黴、重組大腸桿菌和重組畢赤巴斯德酵母表達的β-葡萄糖醛酸苷酶（分別稱為PGUS、PGUS-E和PGUS-P），其純度分別為92.1%、98.3%和95.3%。糖基化分析表明，PGUS-P為N-糖基化翻譯後修飾，而PGUS和PGUS-E無明顯糖基化修飾；2、酶學性質比較分析表明，三種β-葡萄糖醛酸苷酶最適pH、最適反應溫度、對底物對硝基苯-葡萄糖醛酸苷（PNPG）和甘草酸的催化反應動力學參數及催化水解甘草酸模式均有顯著差異；3、去糖基化後的β-葡萄糖醛酸苷酶，其最適反應溫度未明顯變化，但最適pH值範圍增大，對金屬離子敏感性降低且與底物PNPG和甘草酸的親和力均增強，耐變性劑、有機溶劑及表面活性劑能力均下降，更容易被胰蛋白酶水解且酶的熱變性溫度Td 和ΔH均下降，酶蛋白的熱穩定性降低；4、經過近紫外圓二色和螢光光譜分析，去糖基化處理未改變β-葡萄糖醛酸苷酶酶蛋白的二級結構，但誘導了酶蛋白分子伸展及其三級結構的改變，N-糖基化有利於提高酶蛋白去摺疊中間態的自由能變ΔG，從而增加其構象穩定性；5、嘗試將β-葡萄糖醛酸苷酶基因在CHO中進行表達，實現了複雜糖型酶的糖基化，獲得具有催化特異性的重組β-葡萄糖醛酸苷酶（PGUS-C），並初步研究了其酶學特性；6、利用三種表達系統的全細胞為催化劑分別在不同的離子液體中進行生物轉化合成GAMG的結果顯示，全細胞酶PGUS在[Bmim]PF6/水雙相介質體系中可以有效的合成GAMG。與傳統發酵法相比，全細胞PGUS催化縮短了催化時間，提高了生產效率，具有較好的穩定性和重複使用性。在該基金的資助下，共發表SCI論文14篇，國際會議論文18篇，國內會議論文6篇，共培養研究生8名，其中博士3名。
